百邁客是國內(nèi)首批推出推出空間轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)（百邁客邀您體驗新技術(shù)——空間轉(zhuǎn)錄組），以及國內(nèi)研發(fā)植物空間轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（百邁客新品-植物空間轉(zhuǎn)錄組挑戰(zhàn)與機遇），突破了物種的限制性，還在FFPE樣本上實現(xiàn)了客戶古董珍貴樣本的空間轉(zhuǎn)錄組測序（百邁客 10x Visium FFPE 空間轉(zhuǎn)錄組預(yù)售正式啟動?。粌H拓展了空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)樣本適用范圍，也擴展了該技術(shù)在新領(lǐng)域的應(yīng)用。

當(dāng)然新技術(shù)的發(fā)展依賴于樣本的精細(xì)處理，特別是植物樣本處理和要求跟動物樣本要求有一些不同，百邁客經(jīng)過十幾種物種、上百種組織類型的測試，積累了大量的樣本處理經(jīng)驗，建立一套穩(wěn)定組織樣本包埋方法，今天為各位老師獻(xiàn)上植物空間轉(zhuǎn)錄組實驗開展中樣本準(zhǔn)備相關(guān)資料，讓您的實驗不再局限于取材階段，推動不同物種、不同組織類型在空間基因表達(dá)模式的檢測，提供單細(xì)胞空間多維度探索動植物生長發(fā)育、抗逆應(yīng)激、免疫反應(yīng)、生物進(jìn)化等應(yīng)用技術(shù)手段。

首先我們回顧一下在百邁客新品-植物空間轉(zhuǎn)錄組挑戰(zhàn)與機遇中提到的植物空間轉(zhuǎn)錄組實驗流程：新鮮組織取材-組織冷凍包埋-冷凍切片-甲苯胺藍(lán)染色-組織優(yōu)化-建庫測序-數(shù)據(jù)分析，因為植物組織結(jié)構(gòu)上跟動物組織存在很大差異性，在前期樣本準(zhǔn)備取材工作就顯得尤為重要，接下來我們就植物組織樣本準(zhǔn)備和冷凍包埋過程做一個總結(jié)：

樣品處理和包埋注意事項

(1) 客戶在制備樣本時，需要準(zhǔn)備8-10個包埋塊/樣（質(zhì)檢、切片厚度調(diào)整、捕獲區(qū)域確定）：一份用于常規(guī)RNA提取，以確保樣本自身及樣本制備不存在問題，當(dāng)RNA RIN>7.0時，可進(jìn)行后續(xù)實驗；另外部分用于正常的切片厚度調(diào)整(10-50μm)和捕獲區(qū)域確定以及正式實驗；

(2) 目前Visium芯片捕獲區(qū)域大小為6.6×6.5mm2, 因此對組織包埋塊的大小有一定要求（≤6.5mm3） ,較小的組織可建議多個組織包埋在一起，組織間隔盡量小，但是不要重疊，多個組織保持在一個水平面，厚度滿足1mm以上即可

話不多說，直接獻(xiàn)上百邁客植物空間轉(zhuǎn)錄組液氮異戊烷冷凍OCT包埋標(biāo)準(zhǔn)樣本制備詳細(xì)步驟攻略，我們先睹為快！
插入視頻：

相信看完了視頻，大家對組織變成白色的OCT包埋塊有了清晰的認(rèn)識，那這個過程發(fā)生了哪些反應(yīng)呢？小編這里給大家一一講解此次夢幻傳奇之旅：

傳奇穿越之旅-裝備攻略

首先需要準(zhǔn)備此次穿越之旅必備裝備，才能穿過重重阻撓，實現(xiàn)組織到包埋塊到切片的華麗蛻變。武器裝備材料如下：

1. OCT包埋劑（一級裝備）：美國櫻花OCT冷凍切片包埋劑SAKURA ，貨號：4583，規(guī)格：118 mL/瓶，獲取途徑，各種武器店供應(yīng)商有現(xiàn)貨，百元大洋左右，必不可缺，一瓶就可以完成上百次穿越旅行；

2. 包埋盒（一級裝備）：冷凍切片OCT包埋盒，7x7x5mm，物廉價美，某寶上只要20元左右就可獲取百件同等級別裝備；

3. 異戊烷（一級裝備）：CAS號78-78-4，規(guī)格500 mL，可直接購買，但裝備易燃，請小心使用；

4. 液氮、1xPBS、鑷子、剪刀、冰塊、培養(yǎng)皿（二級裝備）、吸水紙：可購買或自行配置。

圖1：裝備攻略示意圖

在無菌超凈臺中，用異戊烷（足以完全浸沒組織包埋盒）填充三分之二的金屬燒杯，然后放入液氮杜瓦瓶中（液氮與異戊烷保持相同的水平面）以充分接觸，孵育 5-10 分鐘，時間不宜太久，防止異戊烷凝結(jié)。

將包埋盒（冷凍切片OCT包埋盒，7x7x5mm）放置在冰上，標(biāo)記包埋盒（組織放置的方向、樣品名稱等）（可拍照記錄），在包埋盒底部加入適量的OCT包埋劑（美國櫻花OCT冷凍切片包埋劑SAKURA ，貨號：4583，規(guī)格：118 mL/瓶），約1/4深度，微凝固后待用，防止組織沉底直接接觸包埋盒底部；

圖2 包埋劑、沖洗液、包埋盒、異戊烷預(yù)處理示意圖

FAQ 1: 植物組織必須要進(jìn)行液氮異戊烷凍存嗎，能否用其它方法替代？

答：目前植物細(xì)胞具有細(xì)胞壁和液泡，細(xì)胞中存在大量水分更容易在低溫冷凍過程中形成冰晶，損傷植物組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)形態(tài)，而且冷凍后植物樣品比動物樣品硬度大，難以切片和保持植物組織結(jié)構(gòu)的完整性。常用方法直接包埋法、液氮速凍法【1】以及繁瑣的FAA、多聚甲醛或乙醇等固定液固定都無法快速得到較好的植物組織冷凍切片效果，這里推薦了液氮異戊烷冷凍-OCT包埋法（百邁客已經(jīng)完成近1000個樣本測試），液氮可以快速冷凍，組織在異戊烷中未直接接觸液氮既可以防止RNA降解，還避免形成晶體，防止組織形態(tài)受損。如果組織類型硬度較大或者木質(zhì)化程度較高或者組織器官存在很多空隙樣本，可以推薦蔗糖溶液作為冷凍保護液，將植物組織放在合適濃度蔗糖溶液中固定，用對應(yīng)濃度的蔗糖磷酸緩沖液浸洗，最后抽真空的方法可較大達(dá)到包埋切片效果。

FAQ 2: 植物組織包埋劑選擇，是否必須使用OCT包埋劑？

答：目前空間轉(zhuǎn)錄組推薦使用標(biāo)準(zhǔn)包埋劑就是OCT（櫻花牌，SAKURA ，4583），必須使用，已經(jīng)在Stefania[2][3]方法中得到驗證，在植物器官組織表面涂抹一層OCT組織包埋劑（水溶性乙二醇和樹脂組成）可以較好保存組織切片的完整形態(tài)，其優(yōu)點在前期提到過：
1）保留組織結(jié)構(gòu)并在冷凍切片過程中提供結(jié)構(gòu)支撐；
2）在切片過程中保持最*溫度，從而使切片光滑；
3）由于其水溶性，可與多種染色程序兼容。通過櫻花牌OCT包埋劑可以達(dá)到植物空間轉(zhuǎn)錄組測序樣本制備的要求。

FAQ 3：所有的試劑、包埋盒是否都需要在冰上操作？

答：是需要，為了降低植物組織RNA降解的可能，需要對相應(yīng)的器具、試劑放在4℃環(huán)境中預(yù)冷，也就是前期一些工作需要在冰上操作完成，盡可能減少組織RNA的降解。

傳奇穿越之旅-取材攻略

從活體植株上取下新鮮目標(biāo)區(qū)域組織置于培養(yǎng)皿中，利用4℃預(yù)冷的鑷子和剪刀盡量將組織裁剪成 6.5mm3大?。ù笮∫m宜，現(xiàn)階段芯片大小為6.5×6.5mm2，一般組織覆蓋率達(dá)到芯片25%以上，低于25%建議多個包埋），利用預(yù)冷的蒸餾水將組織沖洗三次，用吸水紙輕輕吸干組織表面的溶液。

圖3 植物空間轉(zhuǎn)錄組組織樣本取材預(yù)處理示意圖

FAQ 4：可否使用其他植物組織緩沖液？

答：本方法推薦蒸餾水作為植物組織表面清洗緩沖液，不建議直接用1xPBS作為植物組織表面清洗緩沖液，為了維持組織形態(tài)結(jié)構(gòu)原始穩(wěn)定性，高濃度PBS會導(dǎo)致植物組織細(xì)胞容易收縮變形，選擇蒸餾水可以簡單快速清洗干凈表面污漬。如果采用蔗糖溶液作為冷凍保護液，可以采取相應(yīng)濃度蔗糖（1x PBS配置）做為植物清洗緩沖液。

FAQ 5：植物組織太小該如何包埋才能最大限度利用芯片覆蓋度？

答：為了保證最大限度利用芯片覆蓋度，解決組織樣本太小情況，這里推薦多個組織包埋在一起，組織間隔盡量小，但是不要重疊，多個組織保持在一個水平面，如上圖所示。另外一定要備注清楚方向和每個樣本形態(tài)結(jié)構(gòu)，后續(xù)數(shù)據(jù)分析，需要清楚知道對應(yīng)樣本切片位置，此時應(yīng)該清楚備注每個樣本方向和位置信息。

傳奇穿越之旅-冷凍包埋

在冰上操作，用鑷子輕輕夾住組織，緩慢加入預(yù)冷的OCT包埋劑，直至OCT完全包裹組織，并調(diào)整組織在OCT中的位置，保證目標(biāo)平面與切面水平一致，尤其是多個組織包埋一定要排列整齊，避免重疊在一起，此過程中避免產(chǎn)生氣泡，如有氣泡產(chǎn)生用用針尖輕緩挑出氣泡。

圖4 植物空間轉(zhuǎn)錄組組織OCT包埋示意圖

圖5 植物組織塊在包埋盒中示意圖

選擇最小規(guī)格包埋盒（7*7*5mm），組織塊合適大?。?.5mm3）

用鑷子夾緊包埋盒，使異戊烷沒過其底部但不淹沒整個包埋盒，不要使異戊烷浸入包埋盒內(nèi)（組織不直接接觸異戊烷），當(dāng)OCT由透明轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆煌该鞯陌咨珘K狀時，組織基本完全凍結(jié)，取出包埋盒并放入-80℃冰箱保存（在室溫下，異戊烷溫度會迅速升高，冷凍過程中一旦異戊烷升溫，需要馬上置于液氮中重新冷卻）或直接進(jìn)行切片。冷凍時間可根據(jù)組織類型和大小而變化。

圖6 植物組織塊液氮異戊烷冷凍示意圖

圖7 植物組織塊根、莖、胚芽鞘、花苞、芽等組織液氮異戊烷冷凍OCT包埋塊示意圖

傳奇穿越之旅-密封運輸

將 OCT 包埋的組織塊或者包埋盒直接保存在–80℃的密封容器中（一般利用錫箔紙包裹整個包埋盒或者扣下包埋塊將包埋塊放入50 mL離心管密封處理），并做好樣本信息標(biāo)記，利用干冰運輸。

圖8 植物組織OCT包埋塊密封處理示意圖

FAQ：這種液氮異戊烷冷凍-OCT包埋的植物組織可以-80℃存放多久？

答：2個月。理論上密封處理后可以-80℃長期保存，與動物組織不同，植物組織脆弱性和結(jié)構(gòu)特異性，液氮異戊烷冷凍-OCT包埋的植物組織在-80℃可以儲存2個月左右，就要進(jìn)行切片實驗和后續(xù)實驗，不然也會影響切片效果和RNA降解。

本期【空間轉(zhuǎn)錄組】植物組織到冷凍切片的傳奇穿越之旅基本上到此就告一段落，后需會繼續(xù)為大家奉上第二部傳奇之旅，詳細(xì)說明植物組織冷凍切片如何實現(xiàn)空間位置基因表達(dá)信息的穿越，這其中又有經(jīng)過多少難關(guān)才能實現(xiàn)我們的最終穿越。欲知更多百邁客植物空間轉(zhuǎn)錄組后續(xù)實驗和實測數(shù)據(jù)分析，盡在下期分享，敬請期待。

百邁客空間轉(zhuǎn)錄項目經(jīng)驗

圖9. 百邁客空間轉(zhuǎn)錄組動物冷凍組織切片HE染色

圖10. 百邁客空間轉(zhuǎn)錄組植物冷凍組織切片甲苯胺藍(lán)染色

百邁客空間轉(zhuǎn)錄組優(yōu)勢

◆多物種：人、鼠、哺乳動物、植物等多物種均可開展空間轉(zhuǎn)錄組檢測服務(wù)

◆多樣本類型：冷凍組織、FFPE組織多種組織類型都可以實現(xiàn)空間轉(zhuǎn)錄組測序

◆ 設(shè)備全：擁有冷凍切片機、石蠟切片機、多系統(tǒng)熒光顯微鏡，可滿足多樣本空間轉(zhuǎn)錄組高通量測序，一次性多通道、多樣本，實現(xiàn)高效空間轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)；

◆ 經(jīng)驗豐富：國內(nèi)首批引進(jìn)10x visium 空間轉(zhuǎn)錄組測序平臺，目前累計成功制備50余種組織類型、1000+例的空間轉(zhuǎn)錄組樣本

◆強大生信分析：可提供基本分析和高階分析，滿足個性化調(diào)整

◆全套服務(wù)：組織樣本切片、固定、透化、建庫、測序、數(shù)據(jù)分析全套服務(wù)

◆單細(xì)胞和空間云分析平臺：百邁客云平臺已經(jīng)研發(fā)快速高效的云平臺，可高效呈現(xiàn)高質(zhì)量文章圖表和對大數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘；

◆空間轉(zhuǎn)錄組&單細(xì)胞聯(lián)合分析：空間轉(zhuǎn)錄組多組學(xué)聯(lián)合分析，可近似實現(xiàn)單細(xì)胞分辨率空間轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)特征，交互式分析。

百邁客年末促銷，鉅惠來襲

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參考文獻(xiàn)：

[1]陸振芳, 蔣素華, 江敏,等. 蝴蝶蘭花器官冰凍切片技術(shù)探討[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2019, 053(002):200-206.

[2] Giacomello S, Salmén F, Terebieniec BK, et al. Spatially resolved transcriptome profiling in model plant species. Nat Plants. 2017 May 8;3:17061.

[3] Giacomello S, Lundeberg J. Preparation of plant tissue to enable Spatial Transcriptomics profiling using barcoded microarrays. Nat Protoc. 2018 Nov;13(11):2425-2446.

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