宏基因組（NGS）
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宏基因組技術(shù)介紹
宏基因測(cè)序是通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)環(huán)境樣品中全部微小生物遺傳物質(zhì)，包含了可培養(yǎng)的和未可培養(yǎng)的微生物的基因組進(jìn)行測(cè)序分析，以微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系為研究目的的新的微生物研究方法。
產(chǎn)品熱點(diǎn)
無(wú)需分離培養(yǎng)，可鑒定環(huán)境樣品中物種組成和功能組成；
分辨率高，可檢測(cè)環(huán)境樣品中極低豐度物種；
可獲得環(huán)境樣品中全面的功能基因信息,涵蓋碳氮磷硫代謝、抗性基因等；
可組裝獲得環(huán)境中單菌基因組信息 ；
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)到信息分析一站式服務(wù)
提供全面的宏基因組研究的方案設(shè)計(jì)和售后服務(wù)，豐富的標(biāo)準(zhǔn)分析以及個(gè)性化分析多角度闡明環(huán)境微生物潛在的功能和作用機(jī)制。
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方案確定
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提取檢測(cè)
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建庫(kù)測(cè)序
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信息分析
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售后服務(wù)
分析內(nèi)容
技術(shù)策略與送樣要求
?測(cè)序策略：NovaSeq PE150
DNA送樣要求：DNA濃度≥1ng/ul（Qubit），DNA質(zhì)量≥30μg（Qubit），DNA電泳條帶清晰，無(wú)降解或者輕度降解。
| 環(huán)境樣品 | 送樣要求 | 保存及運(yùn)輸 |
| 普通土壤 | 除去土壤表層未分解的凋落物層、動(dòng)植物殘?bào)w、石礫等雜質(zhì)，將大塊的樣品搗碎，過(guò)2mm篩后，分裝至2mL或更大體積的EP管或凍存管中；每管土壤含量大概0.25~0.5g，需保證送樣量在1~2g。 | 樣本-80℃或液氮中長(zhǎng)期保存，干冰運(yùn)輸 |
| 根際土壤 | 收集植物植株，去除根部大塊土壤；搖動(dòng)植株去除附著不緊密的土壤，使用無(wú)菌刷子收集根部附著緊密的土壤；隨機(jī)多點(diǎn)取樣5-10g，過(guò)2mm篩后，分裝至2mL或更大體積的EP管或凍存管中；每管土壤含量大概0.25~0.5g，需保證送樣量在1~2g。 | |
| 糞便 | 無(wú)菌牙簽或糞便取樣器截取樣品中段內(nèi)部（避免表層中的腸道膜脫落細(xì)胞），外部容易污染且細(xì)菌DNA由于接觸空氣可能有降解。將已取的糞便樣品分裝至2mL?EP管（無(wú)菌）或凍存管（無(wú)菌）中，每管糞便量為0.5~2g，每個(gè)樣品分裝2~3管備份。 | |
| 腸道內(nèi)容物 | 在實(shí)驗(yàn)對(duì)象死亡后，無(wú)菌條件下，取出整個(gè)腸道，用無(wú)菌解剖刀切取所需腸段的，用無(wú)菌手術(shù)刀挖取內(nèi)容物分裝至2mL?EP管（無(wú)菌）或凍存管（無(wú)菌）中，每管組織量為0.5~2g，每個(gè)樣品分裝2~3管備份 | |
| 水體 | 過(guò)濾大量低微生物含量的清亮水樣用0.22μm?的聚苯醚砜濾膜，每個(gè)樣本至少1L水樣。渾濁水樣使用0.22μm濾膜過(guò)濾緩慢容易堵塞時(shí)，建議使用0.45μm的混合纖維素酯濾膜，每個(gè)樣本0.5L-1L水樣；如果水樣中不可溶解的顆粒較多，需要使用2-5μm孔徑的濾膜將不可溶解的顆粒雜質(zhì)濾去，再使用0.22μm或0.45μm的濾膜富集菌體，每個(gè)樣本0.5L-1L水樣。 | |
| 空氣 | 開動(dòng)采樣儀（浮游細(xì)菌采集器），使被測(cè)空氣濾過(guò)凝膠膜（滅菌），空氣中的浮游菌被截留在凝膠膜上（過(guò)濾時(shí)間越長(zhǎng)，收集的空氣中的灰塵越多，菌數(shù)量越多），收集完成后取下濾膜。 |
產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)與項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)
豐富的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)與專業(yè)的信息團(tuán)隊(duì)，提供全面準(zhǔn)確的信息分析。
高水平分析團(tuán)隊(duì)
豐富的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)
全面的分析內(nèi)容
專業(yè)的售后服務(wù)
成功案例
物種注釋
使用diamond軟件將質(zhì)控后的高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到 nr數(shù)據(jù)庫(kù)，得到樣品的物種組成和相對(duì)豐度信息。
物種組成的主成分分析
主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)是一種分析和簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)集的技術(shù)，通過(guò)將方差進(jìn)行分解，將多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標(biāo)圖上，坐標(biāo)軸取能夠最大反映方差 的兩個(gè)特征值。通過(guò)分析不同樣品物種組成可以反映樣品間的差異和距離。PCA圖上兩個(gè)樣品距離越近，則表示這兩個(gè)樣品中物種的組成越相似。使用R語(yǔ)言工具分別繪制不同分類水平PCA分析圖
物種進(jìn)化分析
基于樣品物種組成信息，使用軟件MetaPhlAn2繪制物種進(jìn)化分枝圖，可以展示樣品所含物種的系統(tǒng)進(jìn)化信息。
微生物基因功能注釋
將預(yù)測(cè)到的非冗余基因與Nr、GO、COG和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，獲得基因功能注釋信息，了解環(huán)境中微生物潛在的生物學(xué)功能。
CAZy 數(shù)據(jù)庫(kù)功能注釋
CAZy是碳水化合物酶相關(guān)的專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)，內(nèi)容包括能催化碳水化合物降解、修飾、以及生物合成的相關(guān)酶系家族。
CARD功能基因組成分析
在注釋時(shí)，使用CARD數(shù)據(jù)庫(kù)中的工具軟件rgi將非冗余基因的蛋白序列分別數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，找出比對(duì)上的數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)應(yīng)序列，并得到對(duì)應(yīng)的抗性基因和抗性相關(guān)信息。
差異基因功能富集分析
通過(guò)比較不同環(huán)境下微生物基因的豐度，尋找不同環(huán)境下存在的差異基因并對(duì)這些差異基因做功能富集分析，研究微生物對(duì)不同環(huán)境的響應(yīng)機(jī)制。
功能基因組間差異
使用Welch’s t-test進(jìn)行組間差異參數(shù)檢驗(yàn)；如果超過(guò)兩組，使用ANOVA分析進(jìn)行組間差異參數(shù)檢驗(yàn)。通過(guò)參數(shù)檢驗(yàn)獲得的不同功能基因水平的豐度熱圖
案例一
Prevalence of antibiotic resistance genes and bacterial pathogens along the soil-mangrove root continuum
發(fā)表時(shí)間：2021
合作單位：中山大學(xué)
發(fā)表期刊： Journal of Hazardous Materials
研究背景：植物的根往往被土壤細(xì)菌所侵染，這些細(xì)菌被認(rèn)為是抗生素抗性基因(ARGs)的主要接納體。ARGs可以在這些微生物和病原體之間轉(zhuǎn)移，但這些ARGs和病原體在多大程度上從土壤傳播到植物的機(jī)制還不清楚。本研究使用擴(kuò)增子和宏基因組測(cè)序研究了紅樹林幼樹土壤4個(gè)與根系相關(guān)的空間，揭示病原菌可能沿土壤-根系連續(xù)體傳播的途徑。
測(cè)序策略： 16S V3+V4 Illumina Hiseq 2500 PE250 + 宏基因組 Illumina PE150
研究結(jié)論： 91.4%的ARGs在4個(gè)與根系相關(guān)的空間共享，與微生物區(qū)隔選擇動(dòng)力學(xué)不同，導(dǎo)入-以一種連續(xù)的方式散布在土壤-根系連續(xù)體上。這種傳播與潛在的根系相關(guān)的細(xì)菌和真菌微生物群無(wú)關(guān)，但可能是由多種可移動(dòng)遺傳元素促進(jìn)的。創(chuàng)傷弧菌、致病性大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌作為多藥耐藥病原菌，在4個(gè)隔室中均占主導(dǎo)地位，表明抗生素病原菌可能沿土壤-根系連續(xù)體傳播 。
參考文獻(xiàn)： Wang C, Hu R, Strong PJ, et al. Prevalence of antibiotic resistance genes and bacterial pathogens along the soil-mangrove root continuum.?J Hazard Mater. 2021
土壤-根系界面
土壤-根系連續(xù)體中抗生素抗性菌群和微生物群落的動(dòng)態(tài)
案例二
Synergistic interactions of Desulfovibrio and Petrimonas for sulfate-reduction coupling polycyclic aromatic hydrocarbon degradation
發(fā)表時(shí)間：2021
合作單位：廣東省微生物研究所
發(fā)表期刊： Journal of Hazardous Materials
研究背景：隨著工業(yè)化和城市化進(jìn)程的推進(jìn)，多環(huán)芳烴類污染物在水體沉積物中頻繁檢出，給水生態(tài)安全和人類健康造成極大威脅。本研究通過(guò)結(jié)合梯度稀釋培養(yǎng)法、傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)以及宏基因組這這下學(xué)分析等多種方法手段，深入解析了黑臭河流沉積物中硫酸鹽呼吸耦合多環(huán)芳烴降解的核心功能微生物組。
測(cè)序策略：宏基因組 Illumina PE150
研究結(jié)論：梯度稀釋培養(yǎng)法在顯著降低沉積物中微生物群落復(fù)雜同時(shí)，并未削弱菌群的多環(huán)芳烴降解功能。Desulfovibrio和Petrimonas是硫酸鹽呼吸耦合多環(huán)芳烴降解的核心功能微生物。這兩種微生物通過(guò)潛在的協(xié)同作用促進(jìn)多環(huán)芳烴降解轉(zhuǎn)化。其中，Desulfovibrio主要負(fù)責(zé)通過(guò)羧化途徑將多環(huán)芳烴降解至六氫-2-萘甲酰，而Petrimonas則利用其相對(duì)完整的三羧酸循環(huán)途徑和磷酸戊糖途徑實(shí)現(xiàn)前者多環(huán)芳烴中間代謝產(chǎn)物的進(jìn)一步降解轉(zhuǎn)化。
參考文獻(xiàn)： Qian Y, Xu M, Deng T, et al. Synergistic interactions of Desulfovibrio and Petrimonas for sulfate-reduction coupling polycyclic aromatic hydrocarbon degradation.?J Hazard Mater. 2021
實(shí)驗(yàn)流程
屬水平物種相關(guān)性分析
Q1.宏基因組與微生物多樣性的區(qū)別？
宏基因組將基因組DNA隨機(jī)打斷成若干條小片段，然后在片段兩端加通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序，將得到的reads進(jìn)行組裝后進(jìn)行基因預(yù)測(cè)得到基因序列，眾多基因構(gòu)成環(huán)境中微生物的基因集
微生物多樣性主要針對(duì)核糖體小亞基基因序列進(jìn)行測(cè)序（16s rDNA或者18s rDNA），該基因既存在高度保守的區(qū)域還包括高變區(qū)，通過(guò)特異性引物對(duì)某一段高變區(qū)（如V3區(qū)）或某幾段高變區(qū)（如V3-V4區(qū)）進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，然后與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，可特異性識(shí)別細(xì)菌種類?？偟膩?lái)說(shuō)，微生物多樣性主要告訴我們環(huán)境里有什么微生物，而宏基因組主要告訴我們環(huán)境里的微生物能做什么。
Q2.為什么宏基因組與微生物多樣性物種注釋結(jié)果存在差異？
微生物多樣性和宏基因組都會(huì)分析環(huán)境中物種的種類，但是物種的豐度在二者之間存在一定的差異，第一種原因是微生物多樣性是基于核糖體小亞基基因序列進(jìn)行物種注釋和豐度統(tǒng)計(jì)，但是在不同物種中核糖體基因的拷貝數(shù)不一樣，這會(huì)帶來(lái)一些誤差；第二種原因是二者在建庫(kù)測(cè)序過(guò)程中會(huì)進(jìn)行PCR反應(yīng)，在PCR這個(gè)過(guò)程中也會(huì)存在一些誤差。
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