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摘要

背景: 結(jié)直腸癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因。想要了解結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展和治療，人類腸道微生物菌群是一個熱門的研究領(lǐng)域。多項研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者的腸道微生物群中特定細(xì)菌豐度與健康人群相比有顯著性變化，但是還沒有明確哪沒有一種細(xì)菌與所有病例相關(guān)。目前還不清楚這種變化與癌變的因果關(guān)系，但重點應(yīng)放在解釋與癌癥相關(guān)的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)變化上。

結(jié)果:通過對先前發(fā)表的252份來自健康和晚期結(jié)直腸癌患者的全基因組測序糞便樣本進(jìn)行新的分析，我們確定了癌癥相關(guān)人類腸道微生物菌群的分類、功能和結(jié)構(gòu)變化。根據(jù)這些數(shù)據(jù)分析揭示了健康的腸道微生物菌群和結(jié)直腸癌相關(guān)腸道微生物菌群之間潛在的微生物群落結(jié)構(gòu)變化的顯著差異。發(fā)現(xiàn)在分類學(xué)上和功能上與癌癥相關(guān)的細(xì)菌與其他細(xì)菌形成關(guān)聯(lián)，并且在功能上形成適應(yīng)于與腫瘤相關(guān)的生態(tài)系統(tǒng)中的潛在變化的模塊。通過對這些樣本進(jìn)行的微生物群落分析得到，與癌癥相關(guān)細(xì)菌的物種多樣性顯著增加，被歸類為源自口腔微生物菌群的物種相對豐度增加，包括Fusobacterium nucleatum, Peptostreptococcus stomatis, Gemella morbillorum還有Parvimonas micra等。分析群落功能的差異豐度后得出，與毒力因子和肽降解相關(guān)的功能表達(dá)增加，與結(jié)腸直腸癌腸道微生物菌群內(nèi)氨基酸生物合成相關(guān)的功能表達(dá)減少。

結(jié)論:我們通過對大量晚期結(jié)直腸癌患者和健康受試者得到的全基因組測序糞便樣本，分析出結(jié)直腸癌相關(guān)腸道微生物菌群中發(fā)生的許多潛在的重要分類、功能和結(jié)構(gòu)改變。分析表明，癌癥影響腸道微生物菌群中細(xì)菌的組成，一些特殊的口腔菌群及其相關(guān)菌群可能與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。

實驗方法

材料：178位健康人（男女比例56.18/43.82）和74位晚期(52位三期/ 22位四期，男女比例58.11/41.89)結(jié)直腸癌患者的糞便樣本

方法：宏基因組測序，統(tǒng)計分析

研究方法

細(xì)菌群落分類學(xué)分析

使用基于em的方法計算每個樣本內(nèi)物種的相對豐度，以構(gòu)建一個樣本分類單元矩陣，通過測量每個樣本的細(xì)菌豐富度和Shannon指數(shù)，利用該矩陣探究兩個樣本組(健康和晚期CRC)的微生物多樣性。CRC組的樣本顯示出更大的多樣性，包括豐富度和Shannon指數(shù)(Mann-Whitney U檢驗:MWU);豐富度:MWU pvalue = 0.0005, Shannon指數(shù):MWU pvalue = 0.0009)(圖一a，b)。由于物種多樣性的量度對物種均勻度和豐富度的敏感性不同，還應(yīng)用了辛普森指數(shù)來計算樣本組內(nèi)的物種多樣性，這些結(jié)果與之前的分析一致，CRC樣本中的物種多樣性與健康樣本中的物種多樣性有顯著性差異(MWU值= 0.0238).
評估健康和晚期結(jié)直腸癌相關(guān)腸道微生物群之間的細(xì)菌群落分類特征差異。對樣本分類群矩陣進(jìn)行CLR轉(zhuǎn)換，使用主成分分析進(jìn)行基于分類剖面的樣本排序。前兩個主成分只能解釋總方差的一小部分(PC1: 7.98%，PC2: 5.61%)，基于主成分分析的線性變換未顯示健康樣本與CRC樣本有差異，但通過隨機(jī)森林分類器(RFC)可以區(qū)分兩個樣本組(AUC = 0.87)(圖 2a)。雖然RFC根據(jù)重要性對物種進(jìn)行排序，但這些默認(rèn)度量是有一定偏差。為獲得RFC提供的物種重要度的統(tǒng)計顯著性，在我特征集中包含一個“隨機(jī)”特征。通過使用100個RFC的集合，發(fā)現(xiàn)了17種細(xì)菌，在這些顯著“重要”物種上訓(xùn)練的100個RFC的準(zhǔn)確性分類得分大于在所有物種上訓(xùn)練的100個RFC的準(zhǔn)確性分類得分(所有物種平均準(zhǔn)確性為74%；17個非?！爸匾钡奈锓N平均準(zhǔn)確率為80%(圖 2c)。物種差異豐度分析顯示，與健康腸道微生物組相比，CRC相關(guān)腸道微生物組中有174個物種的相對豐度顯著降低，10個物種的相對豐度顯著升高。這174個細(xì)菌物種分別來自84個屬，大多數(shù)來自 Enterobacter(6.8%)， Klebsiella(6.3%)， Streptococcus(5.2%)， Lactobacillus (5.1%)， Citrobacter(4.6%)， Bifidobacterium(4%)，Bacteroides(3.4%)，以及 Clostridium(3.4%)。CRC中相對豐度顯著升高的10個物種是 Parvimonas micra(qvalue = 3.09e-09)， Peptostreptococcus stomatis(qvalue = 4.51e-08)， Gemella morbillorum(qvalue = 4.55e-08)， Fusobacterium nucleatum(qvalue = 1.08e-06)， Streptococcus anginosus(qvalue = 1.13e-03)， Dialister pneumosintes (qvalue=1.37e-03)，Peptostreptococcus anaerobius (qvalue=4.74e-03)， Streptococcus sp. KCOM 2412（Streptococcus periodonticum)(qvalue = 7.18e-03)， Ruminococcus torques(qvalue = 1.55e-02)，以及ilifactor alocis(qvalue = 2.85e-02)。

有趣的是，許多在CRC中被認(rèn)為非?！爸匾鼻蚁鄬ωS度較高的物種也存在于口腔微生物組中，也與部分口腔疾病(牙周炎、根尖周病變、根管感染、口腔癌等)、CRC風(fēng)險的增加有關(guān)。隨后，我們通過人類口腔微生物數(shù)據(jù)庫(eHOMD)對我們樣本中的所有口腔物種進(jìn)行分類，發(fā)現(xiàn)與健康組相比，CRC相關(guān)腸道微生物組內(nèi)存在的總口腔微生物種群豐富度顯著增加(MWU: pvalue = 6.51e-05)(圖2 d)。

圖1

圖2

細(xì)菌群落功能分析

為分析健康的腸道微生物群落功能和結(jié)直腸癌腸道微生物群落功能的差異，還有蛋白質(zhì)家族特點（TIGRFAMs)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域(Pfams)。主成分分析解釋了樣本組間聚類中等方差分別是PC1: 27.19%、PC2: 4.33%。差異豐度分析顯示12個Pfams(與健康組相比，CRC升高7個，降低5個)和兩個TIGRFAMs(與健康組相比，CRC升高1個，降低1個)的相對豐度具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異(MWU-FDR: qvalue%3C 0.05)。在結(jié)直腸癌腸道微生物組中顯著升高的Pfams與細(xì)菌侵襲素和粘附素(例如FadA)有關(guān)，而顯著降低的Pfams與抗生素抗性、噬菌體成熟和蘇氨酸生物合成有關(guān)。CRC中顯著升高的單一TIGRFAM與脯氨酸亞氨基肽酶相關(guān)，而顯著降低的TIGRFAM再次與蘇氨酸生物合成相關(guān)。

細(xì)菌關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)

首先，計算所有樣本中每種物種的流行率(圖3a)，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌種類流行計數(shù)在組內(nèi)的分布呈現(xiàn)雙峰分布，一個峰值閾值為90%。我們將群體內(nèi)樣本流行率超過90%的物種稱為高度流行物種(HPS)，發(fā)現(xiàn)每一組HPS中的大多數(shù)物種是共享的(健康組:97%，CRC: 95%)(圖3b)。健康組中五個獨特的HPS是:Hespellia stercorisuis,Clostridium saccharolyticum，Monoglobus pectinilyticus, Streptococcus sp. oral taxon 431,和Odoribacter laneus。CRC關(guān)聯(lián)組獨有的八個HPS：Intestinibacillus massiliensis, Prevotella copri, Haemophilus parainfluenzae, Ruminococcus bicirculans, Streptococcus mitis, Neglecta timonensis, Bifidobacterium catenulatum,和Anaerotignum neopropionicum。Streptococcus mitis和 Haemophilus parainfluenzae都被eHOMD歸類為口腔微生物。發(fā)現(xiàn)HPS的相對豐度占樣品總相對豐度82%(圖3c)。除了這些高度普遍和豐富的物種之外，還納入一些被RFC認(rèn)為非?！爸匾钡奈锓N，并發(fā)現(xiàn)它們的豐度存在差異。增加了8個物種(arvimonas micra, Peptostreptococcus stomatis, Gemella morbillorum, Fusobacterium nucleatum, Streptococcus anginosus, Dialister pneumosintes, Peptostreptococcus anaerobius, and Ruminococcus torques)到物種群(共165種)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建中。將多個網(wǎng)絡(luò)屬性與隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)中顯示的屬性進(jìn)行比較來檢查網(wǎng)絡(luò)的非隨機(jī)性，與隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)相比，健康組和CRC都表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)顯著(Monte Carlo Simulation; MCS)；較短的平均最短路徑長度(ASPL)(Healthy and CRC: MCS pvalue<?0.001)，較高的傳遞性(Healthy and CRC: MCS pvalue<?0.001)和更高的模塊化(Healthy and CRC: MCS pvalue<?0.001)。這些結(jié)果表明，構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)顯示出顯著非隨機(jī)的特性，并且網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的物種通過短路徑彼此連接，與它們的鄰近物種具有積極的關(guān)聯(lián)，并且形成模塊(即物種的組或集群)，其特征在于在同一模塊內(nèi)的物種之間發(fā)生的關(guān)聯(lián)占大多數(shù)，而與模塊外的物種存在的關(guān)聯(lián)很少。

圖3

群體網(wǎng)絡(luò)包含相似的關(guān)聯(lián)權(quán)重分布，正相關(guān)比負(fù)相關(guān)更多(圖4a)。值得注意的是，與健康網(wǎng)絡(luò)相比，CRC包含更多的負(fù)相關(guān)。29%的負(fù)相關(guān)涉及一種被認(rèn)為是口腔微生物的物種，而在健康網(wǎng)絡(luò)中，沒有發(fā)現(xiàn)涉及口腔菌群。在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)關(guān)聯(lián)是該網(wǎng)絡(luò)獨有的(健康:69%，CRC:72%)(圖4b)。我們假設(shè)群落結(jié)構(gòu)的這種巨大差異可以反映生態(tài)系統(tǒng)的變化，并進(jìn)而分析了網(wǎng)絡(luò)中物種之間的分類關(guān)系(圖4c)。兩個網(wǎng)絡(luò)在同一屬內(nèi)的物種(健康:MCS pvalue= 0.00099，CRC:MCS pvalue= 0.00099)和家族(健康:MCS值= 0.00099，CRC:MCS= 0.00099 )。然而，只有在健康組的網(wǎng)絡(luò)中，物種與來自同一順序的其他物種的積極相關(guān)仍然明顯多于隨機(jī)相關(guān)(健康:MCS pvalue= 0.00099，CRC: MCS pvalue = 0.44)。與健康網(wǎng)絡(luò)(健康:4%，CRC:17%)相比，CRC的網(wǎng)絡(luò)在分類上的遠(yuǎn)緣關(guān)系中顯示出更大的豐度，在健康網(wǎng)絡(luò)中分類上的遠(yuǎn)緣微生物之間的正關(guān)聯(lián)仍然顯著較少(門內(nèi):MCS值= 0.00099，門外:MCSp值= 0.00099)和CRC(門內(nèi):MCS pvalue= 0.00099，門外:MCS pvalue= 0.00099)而不是隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)。

圖4

通過構(gòu)建CLR轉(zhuǎn)換的模塊功能來比較模塊的潛在功能。模塊功能(蛋白域)圖譜的PCA顯示出較大的差異(PC1: 33.73%，PC2: 14.53%)，模塊似乎形成包含兩組代表的簇團(tuán)(圖 5a)。為了定義模塊的聚類，進(jìn)行了輪廓分析，估計五個聚類作為用于K-均值聚類的最*K值(圖?5b)。通過K-均值聚類定義模塊聚類后(圖?5c)對這些集群進(jìn)行了分類分析。在整個網(wǎng)絡(luò)中，同一集群內(nèi)的模塊被發(fā)現(xiàn)在分類學(xué)上是相似的，不包括簇1和簇5，簇1和簇5顯示出物種占有的變化，其中在健康網(wǎng)絡(luò)的簇1內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一些物種被顯示在CRC組的簇5內(nèi)。然而，兩個網(wǎng)絡(luò)對在簇2、3和4中發(fā)現(xiàn)的物種有很強(qiáng)的一致性。第2組中的物種僅有“致病菌”(即通常無害但在特定環(huán)境條件下具有致病能力的物種)口腔微生物，而簇3主要是鏈球菌種和簇4主要類桿菌種。隨后，進(jìn)行聚類功能分析以發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，以及蛋白質(zhì)家族的主要作用和次要作用，這使得聚類在功能上不同。簇1的功能與細(xì)胞表面粘附、對抗沖突策略、酪氨酸重組酶、多糖降解、糖胺聚糖結(jié)合、腫瘤蛋白酶抑制、過氧化物酶功能、碳水化合物/纖維素結(jié)合活性和氨基酸生物合成相關(guān)。簇2的功能涉及對宿主細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的粘附、細(xì)胞感染、膠原結(jié)合、補體抗性、鳥氨酸/賴氨酸/精氨酸脫羧酶(組織腐敗/多胺合成/酸性環(huán)境抗性)、金屬肽酶、V型分泌系統(tǒng)、氨的產(chǎn)生和有毒金屬離子的排泄(銅流出系統(tǒng))、細(xì)胞包膜、DNA代謝、脂肪酸和磷脂代謝、表面多糖和脂多糖的生物合成和降解。簇3的功能與粘蛋白結(jié)合、鋅清除/吸收、細(xì)胞表面粘附、葡萄糖結(jié)合/轉(zhuǎn)運和銅結(jié)合、蛋白質(zhì)和肽的命運/合成/分泌、多糖/碳水化合物、有機(jī)醇和酸的降解方面有關(guān)。簇4的功能涉及金屬結(jié)合、二瓜氨酸環(huán)化酶/磷酸二酯酶、群體感應(yīng)、碳水化合物結(jié)合和半胱氨酸/木瓜蛋白酶、核苷和核苷酸、轉(zhuǎn)運和結(jié)合蛋白、TCA循環(huán)、鐵攜帶以及表面多糖的降解和生物合成。最后簇5的區(qū)別功能與氨肽酶、三羧酸受體、乙醇胺轉(zhuǎn)運、淀粉利用、木葡聚糖/多糖結(jié)合、能量代謝、氨基酸和胺、陽離子和鐵化合物、電子轉(zhuǎn)運以及表面多糖和脂多糖的生物合成和降解相關(guān)。檢查了在每個集群內(nèi)發(fā)現(xiàn)的用于網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的物種的豐度(健康:簇1 (33%)、簇2 (2%)、簇3 (5%)、簇4 (26%)、簇5 (7%)、無(27%)；CRC:簇1 (19%)、簇2 (3%)、簇3 (3%)、簇4 (12%)、簇5 (30%)、無(33%)(圖6)。我們的發(fā)現(xiàn)表明，與健康組相比，在CRC中，第2類和第5類組模塊中發(fā)現(xiàn)的物種總數(shù)增加，第1類、第3類和第4類組中發(fā)現(xiàn)的物種減少。這些結(jié)果也反映在我們發(fā)現(xiàn)的總樣本相對豐度的統(tǒng)計顯著變化中，即群內(nèi)物種在群間所占的比例(第一組: MWU值= 4.29 e-12；第二組:MWU值= 3.16 e-16；第三組:MWU值= 0.0002；第四組:MWU值= 2.62-13；第五組:MWUp值= 2.81 e-29；無集群物種:MWU值= 4.40-17(圖7)。此外，發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的大多數(shù)負(fù)面關(guān)聯(lián)(健康:100%，CRC:96%)發(fā)生在占據(jù)不同集群類型內(nèi)模塊的物種之間。只有在CRC中，簇1的物種之間才出現(xiàn)集群內(nèi)的負(fù)相關(guān)，其中物種種類和豐度也顯示出減少。

圖5

圖6

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圖7