?百邁客單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組產(chǎn)品介紹

百邁客單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序產(chǎn)品基于10x Genomics Chromium系統(tǒng)利用8通道的微流體 “雙十字”交叉系統(tǒng)和油滴包裹技術(shù)，在單細(xì)胞水平進(jìn)行高通量基因表達(dá)譜檢測(cè)，對(duì)復(fù)雜細(xì)胞群深入分析，表征單個(gè)細(xì)胞的表達(dá)譜，避免單個(gè)細(xì)胞的異質(zhì)性生物學(xué)信息被大量細(xì)胞的均質(zhì)化覆蓋。通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，可鑒定細(xì)胞群、細(xì)胞亞群、篩選細(xì)胞群特有marker基因，并完成對(duì)細(xì)胞分化軌跡的追蹤，從而解析細(xì)胞異質(zhì)性和發(fā)育軌跡。

導(dǎo)讀

背景：骨髓內(nèi)B細(xì)胞的分化具有嚴(yán)格的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)協(xié)調(diào)，這個(gè)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的遺傳物質(zhì)的變異是急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）出現(xiàn)的基礎(chǔ)，例如ETV6-RUNX1融合基因的出現(xiàn)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分化停滯。本研究旨在分析沿B細(xì)胞譜系分化軌跡的轉(zhuǎn)錄因子活性，作為表征白血病骨髓中異常細(xì)胞狀態(tài)的參考，并確定維持癌癥特異性細(xì)胞狀態(tài)的轉(zhuǎn)錄因子，以進(jìn)行更√確的治療。

方法：使用單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）分析正常的B細(xì)胞譜系分化和體內(nèi)細(xì)胞狀態(tài)。

結(jié)果：從骨髓scRNA-seq中發(fā)現(xiàn)的淋巴樣細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子活性與前期ATAC和ChIP-seq數(shù)據(jù)高度一致。使用這種調(diào)節(jié)B細(xì)胞譜系分化的調(diào)節(jié)因子作為綜合參考，本研究對(duì)ETV6-RUNX1融合基因陽(yáng)性的ALL病例的分析揭示了白血病細(xì)胞中多種ETS轉(zhuǎn)錄因子的活性升高，包括白血病全基因組關(guān)聯(lián)研究中ELK3?；虮磉_(dá)變化與白血病免疫微環(huán)境中的自然殺傷細(xì)胞失活和耗竭有關(guān)。此外，結(jié)果表明診斷時(shí)細(xì)胞周期在G1期的細(xì)胞越豐富，誘導(dǎo)化療期間缺乏分化相關(guān)的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)變化，這兩個(gè)特點(diǎn)代表了化療耐藥的特征。為了靶向白血病調(diào)節(jié)程序，克服治療耐藥性，本研究表明抑制ETS轉(zhuǎn)錄因子會(huì)降低細(xì)胞活力。

結(jié)論：本研究提供了表征正常和白血病骨髓中B細(xì)胞譜系分化中轉(zhuǎn)錄因子活性的詳細(xì)圖譜，并為針對(duì)白血病免疫微環(huán)境和調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的新治療策略提供了基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)方法

材料：急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）初診和化療15天的骨髓樣本（BM）

方法：?jiǎn)渭?xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、ATAC-seq、CHIP-seq、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

研究結(jié)果

1、在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中捕獲骨髓B細(xì)胞譜系分化軌跡

從具有11個(gè)cluster的HSC中分離出B細(xì)胞用于進(jìn)一步分析（圖 1a），DNA轉(zhuǎn)移酶（DNTT，也稱為 TdT）和MME（也稱為CD10）基因區(qū)分早期淋巴祖細(xì)胞（LP，cluster 3），它們進(jìn)展為表達(dá)CD19和G1期pro-B細(xì)胞狀態(tài)（圖 1b）。此外，3個(gè)pre-B細(xì)胞cluster（缺乏DNTT表達(dá)）在圖譜上分離。pre-B II和未成熟B細(xì)胞簇由MS4A1（CD20）定義。擬時(shí)序分析如圖1c所示?；诖朔治龅募?xì)胞狀態(tài)之間的進(jìn)展與指定的分化階段一致。這些細(xì)胞狀態(tài)注釋也與使用流式分選B細(xì)胞群評(píng)分高度一致（圖 1d）。然而，這些由大量轉(zhuǎn)錄組定義的基因組僅在循環(huán)細(xì)胞狀態(tài)中得分很高。因此，本研究還從單細(xì)胞分析中區(qū)分了每個(gè)cluster的marker基因，以研究BM中B細(xì)胞譜系細(xì)胞狀態(tài)的分配。為了驗(yàn)證，本研究選了兩個(gè)獨(dú)立的BM數(shù)據(jù)集：分別是健康的成人捐贈(zèng)者和三個(gè)兒童BM樣本。從這兩種分析中，可以重現(xiàn)觀察到的B細(xì)胞譜的連續(xù)性。為了描繪表征早期B細(xì)胞譜系分化中細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變的基因表達(dá)變化，本研究沿著偽時(shí)間軌跡（HSC→LP→pro-B→pre-B→未成熟 B 細(xì)胞狀態(tài)）依次比較了細(xì)胞cluster。使用scDD區(qū)分了2201個(gè)基因的mRNA變化、平均表達(dá)的差異和模式，并且HCA和兒童BM之間具有高度的一致性?；赗NA速度分析該基因組的RNA動(dòng)力學(xué)，進(jìn)一步解析了B細(xì)胞譜系的細(xì)胞狀態(tài)（圖 1e）。在該分析中，剪接和未剪接計(jì)數(shù)均用于評(píng)估基因表達(dá)變化的速度，從而通過基因調(diào)控動(dòng)態(tài)擴(kuò)展細(xì)胞狀態(tài)表征。這由首先上調(diào)的 DNTT（圖 1f）說明這些細(xì)胞周期狀態(tài)和細(xì)胞周期中mRNA水平的變化 （圖1g）。

圖1 骨髓scRNA-seq中分離的B淋巴樣細(xì)胞分化狀態(tài)

2、TF活性變化揭示了B細(xì)胞分化的調(diào)控動(dòng)態(tài)

沿B細(xì)胞譜系軌跡的細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)換受TF嚴(yán)格控制。為了表征TF、共調(diào)節(jié)因子（CR）、染色質(zhì)修飾（CM）和剪接/轉(zhuǎn)錄復(fù)合物（ST）的活動(dòng)，使用在訓(xùn)練集和測(cè)試集中可重復(fù)識(shí)別的TF作為線性模型擬合分析細(xì)胞狀態(tài)的重要預(yù)測(cè)因子。B細(xì)胞譜系分化階段的TF活性評(píng)分如圖2a所示。主要調(diào)節(jié)B細(xì)胞譜系循環(huán)的TF的表達(dá)水平見圖2b。EBF1、FOXO1、LEF1和TCF4與ETS因子ERG和FLI1一起在pro-B細(xì)胞中顯示出*高的活性（紅色），而TCF3和PAX5在pro-B細(xì)胞和pre-B細(xì)胞中的活性都相似。SPIB和IRF4活性在pre-B細(xì)胞中升高；一些已知的具有抑制功能的TF，如BCL11A和已知的協(xié)同抑制復(fù)合成分HDAC2 和TBL1XR1，它們與糖皮質(zhì)激素受體相互作用以促進(jìn)終末分化。

作為獨(dú)立驗(yàn)證，首先從pro-B細(xì)胞中檢索了大量ATAC-seq數(shù)據(jù)，顯著富集的TF motif證實(shí)了與pro-B G1期細(xì)胞相關(guān)的9個(gè)TF（EBF1、FOXO1、TCF3、RFX5、IRF1、TCF4、LEF1、ERG、FLI1）（圖 2c）。pro-B活性TF在兒童BM數(shù)據(jù)集中也具有高度相似的活性譜（圖 2d）。接下來(lái)，分析了包括TF與目標(biāo)基因表達(dá)相關(guān)性，以及每個(gè)目標(biāo)基因位點(diǎn)的TF motif。根據(jù)發(fā)現(xiàn)集中找到的TF，在訓(xùn)練/測(cè)試集中預(yù)測(cè)它們的靶基因。為了測(cè)試預(yù)測(cè)的靶基因是否受TF調(diào)控，本研究檢索了PAX5、EBF1和BCL11A的ChIP-seq數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)在人類細(xì)胞系模型 Nalm-6中可用，使用GREA T獲得與基因關(guān)聯(lián)的peak。對(duì)于PAX5和EBF1，超過75%的預(yù)測(cè)目標(biāo)具有ChIP-seq peak關(guān)聯(lián)（圖 2e）。ATAC-seq motif富集與基于ChIP-seq的TF靶基因位點(diǎn)驗(yàn)證，結(jié)果高度一致，證明TF活性評(píng)分反映了調(diào)節(jié)作用。說明本研究對(duì)健康人BM單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的分析為基因表達(dá)和TF活性變化提供了全面的參考，這些變化表征了單細(xì)胞分辨率下早期B細(xì)胞譜系分化的特征。

圖2 調(diào)節(jié)B細(xì)胞譜系分化的轉(zhuǎn)錄因子活性

3、E/R白血病細(xì)胞類似于pro-B細(xì)胞狀態(tài)，并在細(xì)胞周期活動(dòng)中表現(xiàn)出異質(zhì)性

為了表征ALL（E/R）中常見的TF融合的白血病細(xì)胞，本研究對(duì)6個(gè)兒童E/R+ pre-B-ALL病例進(jìn)行了scRNA-seq，收集6個(gè)診斷期和2個(gè)誘導(dǎo)化療第15天的BM樣本（圖 3a）?；贒NTT表達(dá)及其與正常BM細(xì)胞類型的明確分離，確定了每個(gè)供體中的白血病細(xì)胞簇（圖 3b）?；贐細(xì)胞譜系簇特異性基因集，發(fā)現(xiàn)診斷時(shí)白血病母細(xì)胞類似于pro-B分化狀態(tài)（圖 3c）。該分析同樣將pro-B細(xì)胞鑒定為*接近的正常分化狀態(tài)，這與之前的研究一致。細(xì)胞周期狀態(tài)在不同情況下不同，ALL3中的循環(huán)細(xì)胞比例*低，ALL9中的*高比例（圖 3d）。對(duì)于具有中期誘導(dǎo)治療的2個(gè)病例（ALL10 和 ALL12），在第15天收集的樣本中細(xì)胞分離為不同的細(xì)胞狀態(tài)（圖 3a、d），表明治療進(jìn)一步改變了白血病細(xì)胞狀態(tài)。

通過分別比較循環(huán)和G1期細(xì)胞與正常pro-B細(xì)胞的基因表達(dá)分布，進(jìn)一步表征診斷時(shí)E/R白血病細(xì)胞與pro-B細(xì)胞的不同。該分析是基于HCA健康人BM和兒童BM pro-B細(xì)胞進(jìn)行的。對(duì)于大多數(shù)基因，正常B細(xì)胞譜系分化時(shí)*顯著的變化是ZP指標(biāo)，該指標(biāo)捕獲感興趣基因計(jì)數(shù)為零的細(xì)胞部分，例如前50個(gè)上調(diào)和下調(diào)的基因在 pro-B到pre-B中的過渡。因此，本研究使用ZP對(duì)來(lái)自HCA的E/R+和pro-B細(xì)胞的G1期和循環(huán)細(xì)胞狀態(tài)比較中發(fā)現(xiàn)的272個(gè)上調(diào)和90個(gè)下調(diào)基因進(jìn)行聚類（圖 3e）。與沿B細(xì)胞譜系分化軌跡的其他細(xì)胞狀態(tài)相比，大約1/3的上調(diào)基因在 E/R+ 細(xì)胞（cluter 4）中處于*高水平，而cluter 1、2、5 和 6 中的基因在白血病和正常干/祖細(xì)胞中表達(dá)（圖 3e）。一小部分（19 個(gè)基因，cluter 8）在正常的未成熟 B 細(xì)胞中高度表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)16個(gè)基因僅與小兒BM相比具有顯著性?？紤]到一些基因表達(dá)模式類似于pre-B 細(xì)胞狀態(tài)，但白血病細(xì)胞似乎停滯在pro-B狀態(tài)，因此進(jìn)一步確定了在pro-B到pre-B過渡中通常受調(diào)節(jié)的基因，發(fā)現(xiàn)其他基因與分化停滯有關(guān)?？偟膩?lái)說，在過渡到pre-B狀態(tài)時(shí)正常上調(diào)的 97 個(gè)基因保持在與正常 pro-B 細(xì)胞相似的低水平，而在分化過程中下調(diào)的145個(gè)基因在白血病細(xì)胞中仍然表達(dá)。

通路富集分析顯示，一些上調(diào)基因與細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子通路相關(guān)，特別是那些參與NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性負(fù)調(diào)節(jié)的基因。之前在ALL中的一項(xiàng)研究表明，免疫逃避中 TGF-β增加。因此，與E/R+ G1期細(xì)胞向pro-B G1期細(xì)胞的表達(dá)分布相比，TGFB1和有助于降低NK細(xì)胞募集和激活的3個(gè)基因LY6E、TERF2和HLA-E上調(diào)表達(dá)（圖 3f）。

圖3 E/R+細(xì)胞與正常pro-B細(xì)胞的比較

4、E/R+ BM免疫微環(huán)境中NK細(xì)胞的豐度和活性較低

對(duì)BM免疫細(xì)胞進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)與HCA BM供體相比，E/R+ BM中的GNLY或NKG7陽(yáng)性NK細(xì)胞數(shù)量顯著減少（圖 4a）。此外，根據(jù)流式細(xì)胞分離數(shù)據(jù)，淋巴細(xì)胞中的NK細(xì)胞計(jì)數(shù)在E/R+與非E/R pre-B-ALL中*低（p=0.025）。

為了進(jìn)一步表征免疫細(xì)胞群，將HCA和E/R+ ALL供體的T細(xì)胞和NK細(xì)胞匯集在一起進(jìn)行聯(lián)合分析?；诰垲惡蚼arker基因分析，可以區(qū)分幾種不同的NK細(xì)胞類型（圖 4b、c）。篩選表達(dá)GNLY或NKG7的cluster（cluster 0、2、3、7、10、11、16），發(fā)現(xiàn)與來(lái)自HCA供體的NK細(xì)胞相比，來(lái)自ALL BM的NK細(xì)胞被隨機(jī)分配給這些cluster（圖 4d）。具體來(lái)說，所有NK細(xì)胞主要代表cluster 10和16，它們與表達(dá)未成熟CD56bright 和過渡NK細(xì)胞的顆粒酶 K（GZMK）相匹配（圖 4e 中的基因組評(píng)分代表來(lái)自scRNA-seq研究的NK亞型）。相比之下，大多數(shù)正常 BM NK細(xì)胞代表表達(dá)顆粒酶 B（GZMB）和穿孔素（PRF1）的成熟或終末NK細(xì)胞（cluster 0）。因此，E/R+白血病細(xì)胞可能會(huì)主動(dòng)逃避NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性，然而，NK類型的頻率因供體而異（圖 4f）。高表達(dá)IFNG的cluster 7幾乎完全對(duì)應(yīng)于HCA供體 3，而與其他ALL病例相比，細(xì)胞周期高度活躍的ALL8和ALL9更類似于正常BM中的成熟或活性NK細(xì)胞譜?？傊?，白血病細(xì)胞狀態(tài)與正常pro-B分化狀態(tài)的不同之處在于干/祖細(xì)胞特異性基因和幾種免疫調(diào)節(jié)基因的高表達(dá)。免疫調(diào)節(jié)基因的變化反映為E/R+ BM內(nèi)更多不成熟的NK細(xì)胞類型。

圖4 E/R+骨髓中的NK細(xì)胞數(shù)量和活性較低

5、白血病調(diào)節(jié)程序揭示了 TF 活動(dòng)中的細(xì)胞狀態(tài)和白血病相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)基因

為了進(jìn)一步破譯有助于將E/R+白血病細(xì)胞與正常淋巴細(xì)胞狀態(tài)區(qū)分開的異常TF活性，本研究重復(fù)了TF活性分析（圖 5a）。2/3通過線性模型擬合的TF（R2 > 0.5）在pro-B細(xì)胞中有活性，在E/R+細(xì)胞中活性升高，包括ETS因子（ELK3、ERG、FLI1）、FOXO1、MAX、MAZ 、SP4、TCF4和THAP11。分析還揭示了RFX5和NFYC在 E/R+原始細(xì)胞中的高活性，通常僅在未成熟的B細(xì)胞狀態(tài)下達(dá)到峰值。此外，E/R+細(xì)胞中活性下降的TF包括 RUNX1、SPIB、TCF3 和 IRF4（圖 5a）。

基于bulk RNA分析可以驗(yàn)證它們?cè)贐-ALL中的表達(dá)，在E/R+亞型（紅色箭頭）中檢測(cè)到的比例*高，如在t-SNE圖上比較血液系統(tǒng)惡性腫瘤所示（圖 5b），其中惡性淋巴瘤在圖上突出顯示。兩種常見的B-ALL亞型（E/R+和高超二倍體病例）顯示出類似的高ELK3，而升高的SP4則更具 E/R 特異性，進(jìn)一步分析了E/R+細(xì)胞中的這些TF基因座（圖 5c）。本研究使用GRO-seq對(duì)E/R+ BM中的新生轉(zhuǎn)錄進(jìn)行了分析，揭示了Pol2參與編碼和非編碼區(qū)的主動(dòng)起始和延伸。GRO-seq 證實(shí)了這些基因位點(diǎn)在 E/R+細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性（圖 5c）。此外，還揭示了ELK3上游未注釋（Refseq、UCSC 或 Gencode）的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）（圖 5c）。兩個(gè)lncRNA庫(kù)在該基因組區(qū)域內(nèi)具有匹配的轉(zhuǎn)錄本，但注釋之間的一致性很差。因此，在E/R+ BM（n = 8，scRNA-seq 和 GRO-seq 分析中的匹配樣本）中使用配對(duì)的bulk RNA-seq 進(jìn)一步檢測(cè)了該基因座內(nèi)的剪接模式。帶注釋的ELK3轉(zhuǎn)錄本具有來(lái)自剪接點(diǎn)跨越reads的支持，而上游轉(zhuǎn)錄本與lncRNA結(jié)構(gòu)*匹配（圖 5c）。

圖5 E/R+白血病細(xì)胞中的TF活性

6、化療期間持續(xù)存在的白血病TF為克服耐藥性提供了新的靶點(diǎn)

基于在ALL10和ALL12中誘導(dǎo)治療中期獲得的scRNA-seq譜分析了標(biāo)準(zhǔn)白血病誘導(dǎo)治療（潑尼松龍、長(zhǎng)春新堿、多柔比星）對(duì) TF表達(dá)的影響（圖 5d）?；诓町惙植挤治?，與兩個(gè)樣本中的診斷時(shí)狀態(tài)相比，來(lái)自第15天骨髓的殘余白血病母細(xì)胞具有較低的RUNX1、TCF3、SOX4和ERG表達(dá)，而SMAD1和ELK3水平略有增加。在第29天誘導(dǎo)結(jié)束時(shí)，ALL10的原始細(xì)胞減少（0.08%）。在第15天，pre/未成熟B TFs POU2F2、KLF2/6、AFF3和SPIB在ALL10的剩余白血病細(xì)胞（10%原始細(xì)胞）中的表達(dá)升高。這些變化可能與糖皮質(zhì)激素的分化誘導(dǎo)作用有關(guān)。但總體而言，TF活性或基因表達(dá)的變化不大，表明盡管成熟CD20（由MS4A1編碼）增加，但僅可能發(fā)生向pre-B細(xì)胞狀態(tài)的部分分化。相比之下，ALL3和ALL12對(duì)治療的反應(yīng)緩慢（第 15 天的原始細(xì)胞率為74%和59%；誘導(dǎo)結(jié)束時(shí)分別為0.16%和0.2%）。ALL3與其他E/R+病例相比，診斷時(shí)細(xì)胞周期狀態(tài)分布強(qiáng)烈偏向G0/G1狀態(tài)（圖 3d），這可能是對(duì)靶向分裂細(xì)胞的藥物（阿霉素/長(zhǎng)春新堿）耐藥的基礎(chǔ)。ALL12第15天TF譜表明白血病基因調(diào)控程序的持續(xù)性，表現(xiàn)為缺乏pre-/未成熟B TF上調(diào)（圖 5d）。

總結(jié)

該研究首次全面表征了E/R+ ALL病例中的細(xì)胞狀態(tài)和TF 活性，并將其與單細(xì)胞分辨率下的正常人類 B細(xì)胞譜系分化進(jìn)行了比較，進(jìn)一步證明了使用單細(xì)胞基因組學(xué)監(jiān)測(cè)早期治療反應(yīng)的可行性及其發(fā)現(xiàn)新治療靶點(diǎn)的潛力。通過對(duì)單細(xì)胞和大量基因組數(shù)據(jù)的聯(lián)合分析，表征了導(dǎo)致白血病細(xì)胞異常細(xì)胞表型的TF譜。這些結(jié)果可以為開發(fā)針對(duì)白血病免疫細(xì)胞串?dāng)_和治療抗性白血病細(xì)胞狀態(tài)的新療法提供合理的依據(jù)。

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