研究背景

非小細胞肺癌(NSCLC)是最常見的肺癌類型，包括腺癌、鱗癌和大細胞癌。腺癌是最常見的非小細胞肺癌類型，目前約占所有肺癌病例的40%。近年來發(fā)現(xiàn)了非小細胞肺癌(NSCLC)的基因改變，KRAS、EGFR和ALK是腫瘤基因組驅動因子的最常見癌基因。此外，在約50%的人類癌癥中，P53腫瘤抑制基因發(fā)生突變或缺失。野生型(WT)P53通過調節(jié)參與細胞周期、凋亡、干細胞分化、衰老、DNA修復和代謝的基因的表達，幫助維持基因組的完整性和細胞內穩(wěn)態(tài)。
長鏈非編碼RNA(Long Non-Coding RNAs，lncRNAs)是一種長度超過200個核苷酸的轉錄RNA分子，在細胞核或細胞質中不能翻譯成蛋白質。研究表明，lncRNAs在表觀遺傳調控、細胞周期調控、細胞分化調控等生命活動中發(fā)揮重要作用，并在多種腫瘤中異常表達。lncRNAs的異常表達可作為腫瘤的促進劑或抑制劑。研究表明，lncRNAs通過改變多條信號通路在肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，目前已鑒定出一些與肺癌相關的lncRNAs，如H19、MALAT、MIR31HG、HOTAIR、DGCR5、 AFAP1-AS、SNHG1和RMRP。然而，對其他肺癌相關lncRNAs的鑒定仍有待研究。

研究方法

樣本選擇：LSL-Kras-G12D C57小鼠、Kras-G12D小鼠和P53敲除小鼠。（用表達Cre重組酶的慢病毒顆粒鼻腔滴注8周齡小鼠進而誘發(fā)肺腺癌。腫瘤開始6周后，收集肺腺癌樣本和相應的正常肺樣本。病毒感染后第6天，獲得NONMMUT015812-基因敲除的KP細胞(shRNA-2)和陰性對細胞(sh-Scr)。

測序技術：轉錄組測序和微陣列芯片。

研究結果

1.KRAS-G12D突變和p53基因敲除小鼠肺腺癌中LncRNA的表達

使用芯片技術檢測lncRNA，差異表達lncRNAs的散點圖和聚類圖顯示了肺腺癌和正常肺樣本之間有明顯區(qū)別（圖A、B）。重點研究了在人和鼠之間具有較高差異倍數(shù)且保守的lncRNAs，當FC＞8，P＜0.05時，鑒定到729個lncRNA。根據(jù)染色體位置保守性和序列保守性，篩選出210個具有潛在人類同源物的lncRNA用于后續(xù)驗證，其中129個上調，81個下調(圖C、D)。根據(jù)其基因組位置，將210個lncRNA分為u(基因間)、i(內含子)、x(反義)和o(正義重疊)四大類。已鑒定的lncRNAs大部分屬于i類，有101個(48.09%)(圖E)。

2.與p53、Kras及缺氧相關的lncRNAs分析

p53是臨床肺癌中最常見的突變抑癌基因，在我們的肺腺癌小鼠模型和KP細胞中均被誘導完全敲除。因此，作者探索了所選擇的210個保守的lncRNAs的非調控表達是否與p53的缺失有關。攜帶p53基因的慢病毒顆粒可在KP細胞中重新表達p53。如下圖A所示，p53在穩(wěn)定感染的KP細胞中有效地重新表達。qPCR結果顯示，p53再表達顯著改變了11個lncRNAs的表達（FC≥1.5），且差異倍數(shù)與上述p53缺失的肺腺癌組織芯片數(shù)據(jù)相反(圖B)，表明p53的再表達對LncRNAs的表達有顯著影響。

Kras在肺腺癌小鼠模型和KP細胞中被激活，為了確定與Kras基因相關的lncRNAs的表達量，利用Crispr/Cas9敲除其在KP細胞中的表達。qPCR結果顯示，Kras基因缺失改變了33個lncRNAs的表達（FC≥1.5），且差異倍數(shù)與Kras被激活的肺腺癌組織芯片數(shù)據(jù)相反(圖B)。

缺氧是實體腫瘤的一個顯著特征，低氧腫瘤通常對傳統(tǒng)的癌癥治療有抵抗力，且腫瘤低氧與晚期惡性腫瘤和轉移相關。作者進一步研究了低氧調節(jié)的潛在的lncRNAs。將KP細胞在常氧(20% O2)和缺氧(1% O2)中培養(yǎng)48h，WB結果顯示缺氧可有效上調KP細胞HIF1α的表達(圖A)。RT-PCR結果顯示，缺氧誘導的KP細胞中有13個lncRNAs表達下調，4個lncRNAs在缺氧誘導下表達上調，其表達變化方向與小鼠肺腺癌組織芯片中的表達變化方向一致(圖B)。

芯片篩選出的210個LncRNAs中，有52個LncRNAs的表達變化與p53、Kras或缺氧有關。其中，2個受p53調控的lncRNAs也受Kras調控，2個受KRAS調控的lncRNAs和1個受p53調控的lncRNA在缺氧條件下也可以被調控(圖A)。選擇19個FC＞3.5的lncRNAs，采用定量RT-PCR方法進一步驗證其在6例肺腺癌組織和6例正常肺組織中的表達。定量RT-PCR結果顯示，19個lncRNAs的表達與微陣列結果一致(圖B)。構建與上述19個lncRNAs相關的lncRNA-lncRNA共表達網(wǎng)絡(LLCN)。網(wǎng)絡圖顯示，在19個lncRNAs中，有6個lncRNAs與其他lncRNAs無顯著共表達，有13個lncRNAs與其他lncRNAs顯著共表達（圖C）。

3.NONMMUT015812基因敲除對KP細胞增殖和遷移的抑制作用

在已鑒定的lncRNAs中，NONMMUT015812非常有趣。(a)其在小鼠肺腺癌組織中的表達增加約150-187倍。(b)其表達與p53呈負相關。(c) NONMMUT015812基因位于反轉錄轉座子樣蛋白1基因和甲狀腺素5-脫碘酶基因之間的染色體上，其中包含幾個在人和小鼠中表達差異的lncRNAs。

通過設計慢病毒介導的shRNAs來下調NONMMUT015812的表達，qPCR結果顯示其可使KP細胞中NONMMUT015812的表達減少80%以上(圖A)?？寺⌒纬蓪嶒烇@示，NONMMUT015812基因的敲除顯著抑制了KP細胞的生長(圖B)。此外，在Transwell實驗中，穩(wěn)定的NONMMUT015812基因敲除的KP細胞與對照細胞相比遷移明顯減少(圖C)。流式細胞術分析表明，NONMMUT015812基因敲除導致KP細胞明顯阻滯于G0/G1期，G2/M期細胞數(shù)量減少(圖D)。而NONMMUT015812基因敲除對細胞凋亡無明顯影響。

RNA-seq檢測NONMMUT015812基因敲除細胞基因表達的變化。與陰性對照相比，共鑒定出1281個差異表達基因。在這些基因中，610個基因表達上調，671個基因表達下調(圖E)。KEGG通路分析表明，NONMMUT015812的下調影響了幾個與細胞生長相關的通路，包括細胞周期、DNA復制和PI3K/Akt信號通路(圖F)。有趣的是，KEGG通路的富集還包括p53信號通路和幾條DNA修復通路，這意味著NONMMUT015812可能是p53通路的重要下游調節(jié)因子。與流式細胞儀分析結果一致，未發(fā)現(xiàn)凋亡信號通路。GO分析還表明，許多差異表達基因主要集中在細胞分裂、有絲分裂細胞周期和DNA復制過程中。

小結

本文研究了p53基因敲除和Kras-G12D突變的小鼠肺腺癌中l(wèi)ncRNAs的異常表達。結果顯示，210個lncRNAs（FC≥8）中，原代KP細胞中分別有11個受p53調控，33個受KRAS調控，13個受缺氧調控。在小鼠肺腺癌中顯著上調、受p53再表達負調控的NONMMUT015812，分析其細胞功能，結果表明，shRNAs敲除NONMMUT015812可降低KP細胞的增殖和遷移能力。在小鼠肺腺癌中異常表達的lncRNAs中，NONMMUT015812是一個潛在的促腫瘤基因。然而，已鑒定的lncRNAs在腫瘤發(fā)生中的功能和分子機制及其在人肺癌組織中的表達有待進一步研究。

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