研究背景

NATs（Natural Antisense Transcripts，天然反義轉(zhuǎn)錄本），已報(bào)道可以順式調(diào)控正義鏈基因的表達(dá)水平，增強(qiáng)或抑制局部水平的轉(zhuǎn)錄，或調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性，招募mRNA活化多核糖體翻譯，也可以遠(yuǎn)距離反式調(diào)節(jié)其他基因的表達(dá)。

許多l(xiāng)ncRNA作用被陸續(xù)報(bào)道，尤其是在癌癥進(jìn)展方面。例如反義轉(zhuǎn)錄本ZEB2-AS（ zinc finger Ebox binding homeobox 2），調(diào)節(jié)正義鏈基因ZEB2的可變剪接。ZEB2-AS與ZEB mRNA的5’UTR的結(jié)合阻止了正確的剪接發(fā)生，導(dǎo)致內(nèi)含子保留。該事件增加了ZEB mRNA的翻譯效率，導(dǎo)致癌細(xì)胞的增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移增強(qiáng)。在其他情況下，作為黑素瘤中的SAMMSON，lncRNA的敲低顯示出有效的抗腫瘤發(fā)生活性，表明這類ncRNA在癌癥治療中是有希望的候選藥物靶標(biāo)。因此，鑒定癌癥相關(guān)的lncRNA增強(qiáng)了對(duì)癌癥生物學(xué)以及隨后的腫瘤診斷和治療的認(rèn)知。

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌相關(guān)癌癥，約占所有腫瘤的4％。其發(fā)病率在過(guò)去三十年中增加了3倍。大多數(shù)甲狀腺腫瘤是分化形式，即乳突狀（PTC，75-80％）。PTC共有的遺傳變異，其中包括相互排斥的激活BRAF和RAS（H-，K-和NRAS）突變 – 分別占40-60％和10-15％的病例 – 和RET重排（RET / PTC癌基因）在約20％的病例（Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology）中描述。癌癥基因組圖譜（ The Cancer Genome Atlas Consortium）的大規(guī)模研究和作者的獨(dú)立分析發(fā)現(xiàn)，攜有BRAF基因（特別是_V600E）的體細(xì)胞突變或RET癌基因（RET / PTC）重排的PTC具有高度重疊表達(dá)模式，這種同質(zhì)亞組患者（定義為BRAF樣）與RAS突變或高度相似（RAS樣）的腫瘤樣本相比具有明顯不同的特征。

作者基于PTC的RNA-Seq數(shù)據(jù)，使用從頭發(fā)現(xiàn)方法來(lái)定義BRAF和RAS樣特異性lncRNA的表達(dá)特征，并鑒定能夠調(diào)節(jié)和/或干擾甲狀腺腫瘤中已知癌癥驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的新候選lncRNA。鑒定了一種新的天然反義COMET（COrrelated-to-MET）lncRNA，其在BRAF樣癌中顯著上調(diào)，并且在相同腫瘤中與MET癌基因表達(dá)顯著正相關(guān)。該lncRNA被轉(zhuǎn)錄為MET基因座的反義并具有細(xì)胞質(zhì)定位。COMET特異性siRNA敲低減少了MET致癌基因以及其他MAPK相關(guān)基因的表達(dá)，損害BRAF樣甲狀腺癌細(xì)胞系的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲性。因此，作者用數(shù)據(jù)證實(shí)了lncRNA在腫瘤中的致癌性，提供了新的lncRNA-COMET的新證據(jù)，其可維持腫瘤細(xì)胞的存活和增殖，并有助于甲狀腺乳頭狀癌的MET驅(qū)動(dòng)的侵襲。

材料和方法

RNA-seq數(shù)據(jù)分析，鑒定新的lncRNA。

Fish、RT-PCR、qPCR、RNAi、存活率及凋亡檢測(cè)、克隆形成及增殖檢測(cè)、細(xì)胞侵襲檢測(cè)、Western Blot。

研究結(jié)果

1、基于RNA-seq數(shù)據(jù)鑒定乳突狀甲狀腺癌（PTC）中的新lncRNA?

為了探索PTC中BRAF和RAS樣特異性lncRNA模式，首先在最近發(fā)表的來(lái)自22個(gè)甲狀腺活組織的RNA-Seq數(shù)據(jù)集中建立了從頭轉(zhuǎn)錄組裝的計(jì)算工作流程，定義一個(gè)新的PTC模型轉(zhuǎn)錄組。大于200nt低編碼潛能且與已注釋基因位點(diǎn)無(wú)重疊的轉(zhuǎn)錄本鑒定出454個(gè)新的lncRNA。與蛋白質(zhì)編碼基因類似，已知和新發(fā)現(xiàn)的lncRNA在患者和對(duì)照之間具有顯著差異的表達(dá)水平（FDR <0.05）。202個(gè)lncRNAs的表達(dá)在BRAF和RAS樣PTC之間存在顯著差異（其中77個(gè)在BRAF樣PTC中過(guò)表達(dá)，125個(gè)低表達(dá)），其中60個(gè)未在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋（圖1D和1E;FDR <0.05）。因此，為鑒定尚未注釋的lncRNAs ：i）在PTC中異常表達(dá)，ii）在BRAF-和RAS樣亞組之間差異表達(dá)，iii）在附近定位和iv）與已知癌癥驅(qū)動(dòng)基因高度相關(guān)，作者使用“最近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)”（TSS）方法選擇mRNAs / lncRNAs對(duì)。有趣的是，基于這些標(biāo)準(zhǔn)，將COMET（COrrelated-to-MET）鑒定為新的lncRNA，與MET癌基因正相關(guān)（r = 0.7）。

2、COMET：一種新反義lncRNA，在BRAF樣腫瘤中高表達(dá)，且由MAPK誘導(dǎo)的細(xì)胞質(zhì)lncRNA?

COMET lncRNA比對(duì)到染色體7q31.2，且由MET致癌基因的反義鏈轉(zhuǎn)錄而來(lái)（圖2A），一般認(rèn)知lncRNA具有低表達(dá)，RNA-Seq數(shù)據(jù)顯示COMET表達(dá)顯著低于鄰近的MET癌基因。此外，RNA-Seq還顯示它們都在PTC的BRAF樣亞組中過(guò)表達(dá)（圖2B），表明Ret和B-Raf蛋白的病理性過(guò)度激活有助于它們?cè)黾拥谋磉_(dá)水平。為了證實(shí)這一發(fā)現(xiàn)，根據(jù)常見的體細(xì)胞突變（BRAF_V600E，H-，K-和N-RAS在密碼子12,13和61的突變）和RET基因重排對(duì)以前工作中的一組更大的獨(dú)立樣本（腫瘤n = 50;健康n = 11）分類成BRAF樣（n = 32）和RAS樣（n = 18）亞組。在該獨(dú)立隊(duì)列中，通過(guò)qPCR確認(rèn)NAT lncRNA COMET及其鄰近癌基因MET在BRAF-與RAS樣PTC和對(duì)照樣品中過(guò)表達(dá)（圖2C）。同樣，分析了甲狀腺癌的公共TCGA外顯子組數(shù)據(jù)（THCA; n = 507），并根據(jù)驅(qū)動(dòng)基因改變對(duì)患者進(jìn)行了分類。然后分析了這些患者的RNASeq數(shù)據(jù)，甚至在這個(gè)獨(dú)立且更大的PTC隊(duì)列中證實(shí)了作者的發(fā)現(xiàn)。

為了驗(yàn)證COMET表達(dá)作為Ret和B-Raf蛋白組成型激活的下游轉(zhuǎn)錄事件，檢測(cè)了攜帶BRAF_V600E突變（BCPAP）或RET基因重排（TPC-1）的PTC細(xì)胞系中的COMET水平與永生化正常甲狀腺細(xì)胞系（Nthy-ori 3-1）的比較 。正如所料，COMET以及MET在BRAF樣細(xì)胞系中的表達(dá)顯著高于正常細(xì)胞（圖3A）; 顯示最高COMET表達(dá)水平的TPC-1細(xì)胞系用作下一步大多數(shù)表型測(cè)定的體外模型。

BRAF樣PTC的特征在于ERK介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄程序的過(guò)度激活。這一點(diǎn)促使研究COMET表達(dá)是否在MAPK激活下游被誘導(dǎo)。因此，用表皮生長(zhǎng)因子（EGF）刺激Nthy-ori 3-1細(xì)胞中的RAS-RAF-MEK-ERK途徑。MAPK途徑的誘導(dǎo) – 通過(guò)早期p-Erk增加證實(shí)（圖3B，右圖） – 隨后COMET水平顯著增加（圖3B，左圖）。相反，使用化學(xué)和遺傳方法抑制BRAF突變的BCPAP細(xì)胞系中的組成型活性途徑，通過(guò)用vemurafenib阻斷過(guò)度活化的B-Raf蛋白（圖3C）或BRAF基因KD（圖3D），顯著降低COMET水平。之后評(píng)估了COMET細(xì)胞定位，與qPCR偶聯(lián)的RNA分級(jí)分析顯示，與內(nèi)參蛋白質(zhì)編碼基因（GAPDH）類似，COMET在細(xì)胞質(zhì)RNA部分中具有明顯富集（圖3G）。此外，RNA FISH進(jìn)一步證實(shí)了這種新的NAT lncRNA的細(xì)胞質(zhì)定位（圖3H）。

3、COMET lncRNA敲低可以削弱癌基因的表達(dá)?

為了預(yù)測(cè)COMET的功能并確定其在乳頭狀甲狀腺癌中的潛在生物學(xué)意義，基于共犯原則進(jìn)行分析。利用基于TCGA的lncRNA圖譜TANRIC，使用Pearson相關(guān)性評(píng)估甲狀腺癌樣本中的COMET表達(dá)是否與其他基因的表達(dá)相關(guān)。與初步發(fā)現(xiàn)一致，用鄰近癌基因MET檢測(cè)出最高相關(guān)值（r = 0.88）。此外，對(duì)與COMET顯著相關(guān)（FDR <0.05;r≥0.7）的基因進(jìn)行的通路分析顯示MAPK通路的富集，并且有趣的是，其中一些在來(lái)自TCGA的PTC樣品的BRAF樣群中過(guò)表達(dá)（ 圖4A）。

為進(jìn)一步闡述新的lncRNA與共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的其他基因之間的功能關(guān)系，在BRAF樣腫瘤細(xì)胞中敲低了COMET，并檢測(cè)表達(dá)水平。如圖4B所示，COMET KD顯著損害網(wǎng)絡(luò)中大多數(shù)基因的表達(dá)水平，尤其是AKT3，CREB5和DUSP5。檢測(cè)出COMET?KD后MET mRNA和蛋白質(zhì)水平的顯著下降（圖4C）。為了避免由于siRNA對(duì)MET表達(dá)的脫靶活性引起的任何潛在的混雜效應(yīng)，用相同的COMET特異性siRNA庫(kù)評(píng)估了轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞系的沉默特異性，其表達(dá)MET但不表達(dá)COMET 。在COMET KD后沒有檢測(cè)出該細(xì)胞系中MET癌基因水平的變化，表明COMET特異性siRNA不影響MET癌基因水平。進(jìn)一步測(cè)試了是否可能發(fā)生相互調(diào)節(jié)，即MET KD是否會(huì)影響COMET和屬于COMET共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的其他基因的水平。值得注意的是，在TPC-1細(xì)胞中敲低MET（高達(dá)80％），沒有檢測(cè)出COMET水平以及COMET相關(guān)基因的任何顯著變化（圖4B），表明COMET 敲低后觀察到的基因表達(dá)水平降低與MET無(wú)關(guān)。

此外，為了探索COMET lncRNA及其鄰近癌基因MET的共調(diào)控，評(píng)估了MET誘導(dǎo)刺激是否也能觸發(fā)COMET lncRNA表達(dá)。因此，關(guān)注了已知誘導(dǎo)MET表達(dá)的兩種刺激，即缺氧和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）治療。與在常氧條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞相比，在低氧條件下生長(zhǎng)的TPC-1顯示COMET水平增加2倍（圖4D），揭示缺氧介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)也影響COMET表達(dá)。同樣，用膜c-Met受體配體HGF急性刺激Nthy-ori 3-1也誘導(dǎo)COMET lncRNA水平的增加（圖4E）。值得注意的是，用HGF處理也誘導(dǎo)FOSL2表達(dá)，進(jìn)一步表明其在COMET調(diào)節(jié)中的作用。

4、COMET 敲低抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡，且COMET沉默影響甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲遷移。并在體外評(píng)估了COMET靶向治療的潛力?

由于COMET KD引起c-Met水平的相關(guān)下降，以及甲狀腺癌細(xì)胞中其他MAPK相關(guān)癌基因表達(dá)水平的顯著降低，進(jìn)一步研究了COMET KD對(duì)腫瘤細(xì)胞的表型效應(yīng)。為此在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)量了COMET KD后TPC-1細(xì)胞系的細(xì)胞活力和增殖能力。有趣的是，與對(duì)照無(wú)關(guān)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，COMET-KD活細(xì)胞的百分比顯著降低至~40％（在72小時(shí)）（圖5A）。通過(guò)細(xì)胞增殖測(cè)定檢測(cè)COMET-KD顯著降低細(xì)胞增殖（圖5B）。此外，為了進(jìn)一步了解COMET如何調(diào)節(jié)甲狀腺癌細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)，通過(guò)測(cè)量半胱天冬酶3和7的活性驗(yàn)證了COMET KD是否能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。如圖5C所示，沉默24小時(shí)后COMET KD顯著增加凋亡TPC的數(shù)量 。最后，為了驗(yàn)證COMET KD是否在體外影響甲狀腺腫瘤細(xì)胞的致瘤潛力，檢測(cè)了COMET-KD TPC-1和對(duì)照細(xì)胞的克隆形成能力。如圖5D所示，在菌落的數(shù)量和大小方面，COMET沉默顯著影響甲狀腺癌細(xì)胞的致癌能力。

考慮到COMET沉默對(duì)c-Met蛋白的影響以及在腫瘤侵襲性生長(zhǎng)過(guò)程中的主要作用，進(jìn)一步探討了COMET KD對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞遷移和侵襲性的影響。如圖6A和6B所示，COMET敲低（高達(dá)40％）顯著降低TPC-1細(xì)胞的遷移和侵襲能力。因此，在COMET KD腫瘤細(xì)胞中顯示出上皮 – 間充質(zhì)轉(zhuǎn)換（EMT）標(biāo)記波形蛋白（mRNA和蛋白質(zhì)）的顯著較低表達(dá)，而沒有任何N-鈣粘蛋白表達(dá)的變化（圖6C）?？傊?，這些數(shù)據(jù)支持甲狀腺中新鑒定的COMET lncRNA的體外致癌作用，極具表明這種性質(zhì)至少部分地依賴于其對(duì)MET和MAPK相關(guān)癌基因表達(dá)水平的調(diào)節(jié)活性。

據(jù)報(bào)道，受體酪氨酸激酶（RTK），特別是c-Met受體的激活是腫瘤細(xì)胞逃避vemurafenib（VMR，維莫非尼）介導(dǎo)的突變體B-Raf蛋白抑制的機(jī)制。由于作者數(shù)據(jù)支持COMET可作為MET新的調(diào)節(jié)劑，猜測(cè)它是否也可能作用于BRAF突變的腫瘤細(xì)胞中的vemurafenib反應(yīng)機(jī)制。首先，與TPC-1細(xì)胞類似，評(píng)估COMET沉默對(duì)BRAF_V600E突變的BCPAP細(xì)胞系的生存力（高達(dá)50％）具有強(qiáng)烈影響（圖6D），伴隨MET水平的下降。當(dāng)用VMR處理BCPAP時(shí)，也表現(xiàn)出了類似的效果（高達(dá)60％的細(xì)胞存活率降低）。因此，將敲低COMET的BCPAP細(xì)胞暴露于VMR，以評(píng)估組合治療是否可發(fā)揮累加效應(yīng)。有趣的是，圖6D中數(shù)據(jù)表明，與對(duì)照細(xì)胞（即僅用VMR處理和/或用對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，圖6D）相比，COMET敲低的 BCPAP細(xì)胞具有顯著增強(qiáng)的VMR敏感性，表明在BRAF_V600E突變腫瘤中COMET是提高化療的新靶標(biāo)。

小結(jié)

文章使用de novo發(fā)現(xiàn)方法分析RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，鑒定lncRNA并定義注釋的lncRNA在腫瘤亞型中的特異性。其中，鑒定了COMET（COrrelated-to-MET），一種天然反義轉(zhuǎn)錄物，在含有BRAF_V600E突變或RET基因重排（即BRAF樣腫瘤）的癌癥中高表達(dá)，并誘導(dǎo)下游絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑。在乳頭狀甲狀腺癌中，COMET表達(dá)與MET表達(dá)高度相關(guān)，且與MAPK途徑的不同致癌基因共表達(dá)。COMET的降低導(dǎo)致該網(wǎng)絡(luò)內(nèi)基因的表達(dá)降低，包括MET癌基因。COMET沉默抑制了攜帶BRAF_V600E體細(xì)胞突變或RET癌基因重排的腫瘤細(xì)胞的活力和增殖，并顯著降低了腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和侵襲性。此外，COMET的沉默顯著增加了對(duì)vemurafenib（一種突變的B-raf的常見抑制劑）的敏感性?？偟膩?lái)說(shuō)，研究結(jié)果表明COMET特別是在BRAF突變和MET誘導(dǎo)的乳頭狀甲狀腺癌中可作為一種基于藥物改善癌癥治療的新靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

Esposito R, Esposito D, et al. Oncogenic properties of the antisense lncRNA COMET in BRAF- and RET-driven papillary thyroid carcinomas.Cancer Research,2019.

 

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