組織再生需要細(xì)胞根據(jù)其所在空間位置調(diào)控自我更新和分化。位置記憶能使具有再生能力的細(xì)胞從未受傷的組織獲得空間信息。目前，科學(xué)家們認(rèn)為位置記憶是依賴于某些信號分子的梯度，但有關(guān)它們的信息卻很少被揭示。在這篇文章中，作者以成年斑馬魚魚尾為研究模型，并沿著空間軸（近端，中部，遠(yuǎn)端）對未受傷魚尾的轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組以及造模后魚尾的蛋白組進(jìn)行了定量分析。

 

材料與方法

1、實驗材料：
(1)轉(zhuǎn)錄組測序：
對沿尾鰭近遠(yuǎn)中軸三個位置的每個位置進(jìn)行RNA-seq；近端，中間和遠(yuǎn)端，每個樣本5個生物學(xué)重復(fù)，總計15個樣本。
(2)蛋白組測序：
實施了三次獨立的生物實驗以量化在未損傷鰭中沿近軸軸線的蛋白質(zhì)表達(dá)。
實驗1：收集并匯集來自八只年齡匹配的魚的近端和遠(yuǎn)端區(qū)域。
實驗2：收集并匯集來自20只年齡和性別匹配的魚的背腹和腹側(cè) – 遠(yuǎn)側(cè)區(qū)域。
實驗3：收集并匯集了來自20只年齡匹配和性別匹配的魚的近端，中間和遠(yuǎn)端區(qū)域。中間區(qū)域僅在實驗3中被采樣。
(3)代謝組測序：
分別收獲近端，中間和遠(yuǎn)端區(qū)域來自六只成年魚（三只雄性和三只雌性）。
2、實驗方法：Illumina 測序；LC-MS；Label Free
3、研究策略：轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組

研究結(jié)果

????????為了鑒定可能參與尾鰭位置記憶的候選分子，本研究對未受傷的斑馬魚尾鰭的近端，中間和遠(yuǎn)端區(qū)域進(jìn)行了RNA測序(RNA-seq)和無標(biāo)記定量(LFQ)蛋白質(zhì)組學(xué)(圖1A)，共鑒定出566個轉(zhuǎn)錄本和238個蛋白質(zhì)，主要存在于近或遠(yuǎn)的富集梯度中(圖1B)。另外，主成分分析(PCA)顯示鰭的近端和遠(yuǎn)端區(qū)域之間的轉(zhuǎn)錄物(圖1C)和蛋白質(zhì)(圖1D)豐度的變化很大。中間區(qū)域的轉(zhuǎn)錄本聚集成一個獨特的組，但更接近于遠(yuǎn)端區(qū)域(圖1C)。差異豐富分子的最大差異發(fā)生在近端和遠(yuǎn)端區(qū)域之間，包括1,424個轉(zhuǎn)錄本和113個蛋白質(zhì)(圖1E)。因此，基因組的表達(dá)在整個尾鰭的近遠(yuǎn)端軸上存在著定量的差異。

Fig.1. Transcriptomic and proteomic mapping of positional information in uninjured caudal fins.

圖1 無損傷尾鰭位置信息的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜

        為了確定沿尾鰭近遠(yuǎn)端軸線差異表達(dá)的分子類型，因此對RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了GO分析(圖2A)。轉(zhuǎn)錄因子是細(xì)胞識別的主要監(jiān)管者，因此是位置記憶效應(yīng)物的最佳候選者。在作者的RNA-seq數(shù)據(jù)中編碼轉(zhuǎn)錄因子的693個mRNA中，有53個在尾鰭前緣和末端區(qū)域差異表達(dá)(圖2B)。對應(yīng)于964個跨膜受體中的80個和222個離子通道蛋白中的55個的RNAs在近端和遠(yuǎn)端區(qū)域之間差異表達(dá)。這些命中包括谷氨酸和多巴胺可吸收G蛋白偶聯(lián)受體和幾個Ca2+和K+可滲透通道(圖2C和D)。此外，作者發(fā)現(xiàn)與先前不涉及生長控制或再生的細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑相關(guān)的跨膜蛋白的差異表達(dá)，如ephrin和ednrab。RA，WNT和FGF信號傳導(dǎo)等幾種途徑在附肢發(fā)育和再生期間已知在生長控制和圖案化中的作用，這些信號通路分別包含55，52和41個基因，并確定了12個RA，13個WNT和10個FGF信號傳導(dǎo)途徑基因相反的轉(zhuǎn)錄梯度(圖2E-G)。

Fig.2. Complex differential expression of RNAs identified along proximodistal axis of caudal fin.

圖2 沿著尾鰭近端軸識別的RNAs的差異表達(dá)

        除了遺傳編碼的線索之外，代謝產(chǎn)物可能有助于位置記憶。另外還發(fā)現(xiàn)，幾種代謝酶沿尾鰭的近端軸線差異表達(dá)，包括aldh1l1。此外，近期富集蛋白的GO分析鑒定出與氨基酸代謝和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運有關(guān)的蛋白質(zhì)(圖3A)。使用質(zhì)譜法分析未損傷尾鰭的近端，中間和遠(yuǎn)端區(qū)域的代謝物，單個魚鰭樣品中共定量出125種代謝物。PCA將近端和遠(yuǎn)端魚鰭區(qū)域的代謝物富集聚集成不同的組(圖3B)。幾種代謝產(chǎn)物的豐度在近端和遠(yuǎn)端區(qū)域之間存在差異；26個近端富集，16個遠(yuǎn)端富集(圖3C)。

Fig.3. Metabolites are differentially expressed along the proximodistal axis of the fin.

圖3 在鰭的近遠(yuǎn)端軸上差異表達(dá)的代謝產(chǎn)物

        為了檢驗這種預(yù)測，分別于截肢后1、3天(dpa)，在blastema形成期和生長期(圖4A）對再生鰭的片段進(jìn)行LFQ蛋白質(zhì)組學(xué)研究。為了減少魚類之間的潛在變異，作者從同一條魚中采集了再生鰭的背側(cè)和腹遠(yuǎn)端區(qū)域(雙截肢)。作者發(fā)現(xiàn)3061種蛋白質(zhì)中有97種、11種和2種在0，1和3dpa的背側(cè)和腹側(cè)-遠(yuǎn)側(cè)位置之間差異表達(dá)。在再生過程中不同時間蛋白質(zhì)表達(dá)的PCA顯示1和3dpa的樣品聚集成不同的組，在近端或遠(yuǎn)端區(qū)域之間幾乎沒有變化，而在未損傷的鰭(0dpa)中近端和遠(yuǎn)端區(qū)域之間存在更多變異(圖4B)。然而，在1dpa差異表達(dá)的11種蛋白中，6種在未受損魚鰭(0dpa)中也差異表達(dá)。編碼這些蛋白質(zhì)的三個基因aldh1l1，hsd17b7和muc5.2(圖4C)也通過RNA-seq測量發(fā)現(xiàn)在未受傷的鰭片中差異表達(dá)。UniProt ID F1R4E4的一種無特征蛋白質(zhì)，是唯一在0，1和3dpa差異表達(dá)的蛋白質(zhì)(圖4D)。

Fig.4. Proteomic analyses of proximal and distal regions of regenerating caudal fins identifies proteins that maintain differential expression after injury.

圖4 對再生尾鰭近端和遠(yuǎn)端區(qū)域的蛋白質(zhì)組學(xué)分析確定損傷后維持差異表達(dá)的蛋白質(zhì)

總結(jié)

        位置記憶賦予再生組織兩個關(guān)鍵屬性。首先，離身體近端的截肢比遠(yuǎn)端截肢的再生更快。第二，新的組織是有圖案的。只有損傷部位遠(yuǎn)端的結(jié)構(gòu)才能再生。雖然相當(dāng)多的研究集中在了解不同的生物體是如何開始再生的，并且計算模型已經(jīng)預(yù)測了位置信息如何調(diào)節(jié)再生生長，然而關(guān)于位置記憶的細(xì)胞機(jī)制知之甚少。

        跨膜受體Prod1是位置記憶唯一真正的效應(yīng)者。除Prod1外，小分子維甲酸(RA)也被報道為兩棲類肢體位置記憶的效應(yīng)物。盡管有關(guān)Prod1和RA的這些數(shù)據(jù)，但沒有調(diào)節(jié)位置記憶的分子，在未受傷的附肢中表現(xiàn)出輕微的表達(dá)，并且在物種間保守。普遍假設(shè)預(yù)測位置記憶機(jī)制的分子梯度存在于未受傷的附肢中。因此，本研究測定了沿著成年斑馬魚尾鰭近遠(yuǎn)軸軸線的RNAs，蛋白質(zhì)和代謝物的全局豐度，鑒定了許多不同的圖案分子。這些信息為再生生物學(xué)領(lǐng)域提供了豐富的資源。通過一個復(fù)雜的成魚組織的一個軸的基因產(chǎn)物和代謝物的全局模式，并揭示位置記憶的候選效應(yīng)器。候選物列表提供了一種潛在的標(biāo)記物和效應(yīng)因子，它們在成年附肢的再生和器官大小控制中起著至關(guān)重要的作用。

        在脊椎動物中，在附肢再生期間適當(dāng)?shù)膱D案化受位置記憶的調(diào)節(jié)一種細(xì)胞特性假定依賴于未受傷肢體中分子的梯度。只有一個基因，蠑螈專用，已被證明可以調(diào)節(jié)位置記憶，并在未受傷的肢體中以梯度表達(dá)。確定新的候選人。

        作者繪制了未受傷的斑馬魚尾鰭上RNAs，蛋白質(zhì)和代謝物的豐度。作者確定了數(shù)百個分子梯度，并產(chǎn)生了32個基因和42個代謝物的高信度列表，這些斑馬魚是位置記憶的候選效應(yīng)子。此外，這里發(fā)現(xiàn)的表達(dá)模式可能有助于解釋如何在復(fù)雜的成人組織中保持尺寸穩(wěn)態(tài)和圖案。

 

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