ATAC-seq（染色質(zhì)轉(zhuǎn)座酶可及性測序）是一種高效解析染色質(zhì)開放區(qū)域的技術(shù)，通過Tn5轉(zhuǎn)座酶靶向切割松散染色質(zhì)并標(biāo)記DNA，結(jié)合高通量測序揭示基因調(diào)控元件的位置與活性，在植物生理研究中也被廣泛應(yīng)用。例如，ATAC-seq聯(lián)合RNA-seq和Ribo-seq，揭示茶樹通過染色質(zhì)重塑協(xié)同轉(zhuǎn)錄與翻譯適應(yīng)低溫的分子策略；此外，該技術(shù)還用于擬南芥光信號(hào)響應(yīng)研究，揭示BAF60蛋白通過競爭結(jié)合開放染色質(zhì)區(qū)域調(diào)控光形態(tài)建成的分子機(jī)制等。

本次為各位老師帶來華中農(nóng)業(yè)大學(xué)鄧秀新教授團(tuán)隊(duì)在Plant Journal中發(fā)表的研究論文，題目為“Adventitious embryonic causal gene FhRWP?regulates multiple developmental phenotypes in citrus reproduction”，該文章利用ATAC-seq和轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，探究了柑橘中無性繁殖現(xiàn)象——不定胚發(fā)生的機(jī)制。百邁客生物為該研究提供了ATAC-seq測序服務(wù)。

研究背景

植物的再生和發(fā)育是一個(gè)關(guān)鍵的過程，涉及從組織、器官、愈傷組織甚至具有多能性或多能性的單個(gè)細(xì)胞中重建整個(gè)植物，并通過復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行細(xì)胞命運(yùn)的轉(zhuǎn)化，深入了解植物的再生和發(fā)育，對(duì)于設(shè)計(jì)提高作物再生效率的分子工具至關(guān)重要。

不定胚直接從獲得胚性命運(yùn)的珠心組織細(xì)胞亞群發(fā)育而來，作為有性生殖的替代品，在柑橘和芒果等少數(shù)植物中已有報(bào)道，因此，對(duì)不定胚胎發(fā)生的研究可以為植物再生和發(fā)育的遺傳機(jī)制提供獨(dú)特的視角；由于缺乏合適的遺傳系統(tǒng)來探索潛在機(jī)制，我們對(duì)不定胚和再生之間關(guān)系的理解非常有限，在植物再生工程應(yīng)用中，目前已有部分基因被鑒定并用于促進(jìn)植物再生，從而克服了與物種相關(guān)的局限性，F(xiàn)hRWP的功能和不定胚的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)仍在很大程度上未被了解，已有研究提出，染色質(zhì)重塑復(fù)合體亞基?被認(rèn)為能夠誘導(dǎo)FhRWP的高表達(dá)，該研究通過整合轉(zhuǎn)錄組與染色質(zhì)開放圖景數(shù)據(jù)闡明了FhRWP表達(dá)與其表觀遺傳調(diào)控之間的調(diào)控關(guān)系。

材料及方法

材料：單胚基因型和多胚基因型山橘胚珠、腋芽、幼葉及胚源性愈傷組織等；

方法：ATAC+轉(zhuǎn)錄組+重測序+激素檢測等

研究結(jié)果

1.多胚山橘的開放性染色質(zhì)

為了揭示來自珠粒細(xì)胞的外胚的重編程模式，作者采用ATAC-seq分析了多胚（PO）及單胚（MO）基因型山橘后胚的胚珠的全基因組染色質(zhì)可及性，結(jié)果表明，PO特異性開放染色質(zhì)區(qū)域（ACRs）基因參與了次級(jí)代謝過程、生長正調(diào)控、細(xì)胞分化和正向調(diào)控細(xì)胞生長。

先前的研究表明，一個(gè)顯性基因FhRWP決定了與微型倒重復(fù)轉(zhuǎn)座因子（MITE）插入相關(guān)的不定胚胎的啟動(dòng)，在PO基因型中FhRWP的啟動(dòng)子區(qū)中鑒定到了特異性ACR，而Mo基因型中不含ACR，該ACR與FhRWP啟動(dòng)子區(qū)域的MITE序列重疊，即MITE序列被FhARID1蛋白結(jié)合，這可能是染色質(zhì)重塑復(fù)合體的一個(gè)亞基，這些結(jié)果表明，F(xiàn)hRWP是可及染色質(zhì)的決定因素，參與不定胚胎發(fā)育，與MITE的插入有關(guān)。

山橘基因組中與組織再生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生相關(guān)的hub基因，研究結(jié)果表明，與組織再生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生相關(guān)的hub基因，有12個(gè)ACRs特異性轉(zhuǎn)錄因子在PO和Mo基因型柑橘品種之間存在差異表達(dá)，WUSCHEL（WUS）基因是干細(xì)胞維持的關(guān)鍵調(diào)控因子，在PO基因型柑橘中表達(dá)上調(diào)。FhKRP7kip相關(guān)蛋白（KRP）基因編碼一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKI），是細(xì)胞分裂的負(fù)調(diào)控因子。而FhKRP在PO基因型中下調(diào)了0.59倍?？偟膩碚f，分析顯示，多胚胎基因型可能具有更大的染色質(zhì)可及性區(qū)域，促進(jìn)植物重編程通路相關(guān)基因來調(diào)控不定胚的形成。

2.FhRWP基因的基因編輯結(jié)果展示其在不定胚發(fā)生中的作用

FhRWP基因在胚囊中的表達(dá)是特異性和短暫的，可以從受精前7天開始追蹤，直到后10天，作者采用RNAi方法構(gòu)建了6個(gè)干擾系，發(fā)現(xiàn)FhRWP在6個(gè)干擾系中的表達(dá)量相比PO系顯著降低，但顯著高于Mo基因型，且FhRWP表達(dá)量降低后不定胚數(shù)量也都減少了，這些結(jié)果提示，受FhRWP控制的不定胚表型可能與基因表達(dá)的劑量效應(yīng)有關(guān)。

作者之前的研究顯示的雜合子插入MITE啟動(dòng)子區(qū)域和一個(gè)FhRWP的CDS序列區(qū)域SNP（C-G），導(dǎo)致這個(gè)基因的分裂成兩個(gè)單倍型，M等位基因（MITE）和P等位基因（沒有MITE）。根據(jù)Mo和PO腋芽的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果，作者發(fā)現(xiàn)PO中RWP轉(zhuǎn)錄本高表達(dá)P等位基因，而Mo中M等位基因表達(dá)較小，于是作者構(gòu)建了CRISPR/Cas9載體，以敲除FhRWP，結(jié)果表明，插入MITE可以通過促進(jìn)含有MITE的P等位基因的表達(dá)，同時(shí)減少不插入MITE的M等位基因的表達(dá)，從而改變該基因的表達(dá)模式。雖然FhRWP在ko-47-1和ko-47-2中的FhRWP的表達(dá)下降到與Mo一致的水平，但P等位基因突變導(dǎo)致的過早終止導(dǎo)致了FhRWP功能的喪失，因此，ko-47-1和ko-47-2植株表現(xiàn)出新的表型，如生長遲緩和花芽分化失敗。

此外，對(duì)對(duì)照和轉(zhuǎn)基因株系的腋芽進(jìn)行差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，這些基因在確定植物器官特性和植物器官形成等過程中存在明顯的富集，與開花相關(guān)的FT/TFL1基因家族的表達(dá)也存在差異；此外，有研究表明CEN促進(jìn)了芽的休眠作用，通過酵母單雜交，發(fā)現(xiàn)FhRWP直接調(diào)控FhCEN的啟動(dòng)子區(qū)域。

柑橘胚愈傷組織的誘導(dǎo)具有明顯的基因型依賴性，作者在Mo基因型山橘中過表達(dá)FhRWP的P等位基因CDS，檢測到GFP的植株胚胎愈傷組織增長迅速。qRT-PCR顯示FhRWP表達(dá)高度上調(diào)，細(xì)胞分裂素、ABA和水楊酸激素水平有顯著變化，而生長素和赤霉素水平則無顯著性差異，F(xiàn)hRWP的過表達(dá)有助于Mo基因型山橘莖段上胚胎愈傷組織的形成。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示，WUS和CLV1等再生途徑相關(guān)的低豐度基因表達(dá)上調(diào)，在OE-FhRWP愈傷組織中，WUS與CLV1表達(dá)量增加，與激素分析結(jié)果一致，與ABA和細(xì)胞分裂素合成途徑相關(guān)的基因，包括IPT、CKK、AHK、PYL的表達(dá)存在顯著差異。

3.FhRWP在柑橘多種組織繁殖中的多效性

多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)hRWP在協(xié)調(diào)細(xì)胞命運(yùn)和啟動(dòng)植物再生和繁殖過程中起著關(guān)鍵作用，因此，該研究對(duì)腋芽MO/PO胚珠的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行了整合的轉(zhuǎn)錄組分析。差異基因在花器官發(fā)生和繁殖相關(guān)的生物過程顯著富集，其中來自MADS和WOX等基因家族的轉(zhuǎn)錄因子，包括FhWUS和FhAGL6，均顯著富集，在過表達(dá)的愈傷組織中，共鑒定出354個(gè)差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，GO注釋顯示與胚胎后發(fā)育和再生相關(guān)的過程顯著相關(guān)。值得注意的是，屬于GRF和TALE等基因家族的轉(zhuǎn)錄因子，包括FhAHT1和FhGRF1，表現(xiàn)出顯著的富集，這些基因已被廣泛報(bào)道參與光形態(tài)建成、葉片發(fā)育等信號(hào)通路。

同時(shí)，作者在Mo和PO胚珠中發(fā)現(xiàn)了56個(gè)差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，它們與分生組織維持和胚胎后發(fā)育相關(guān)的過程顯著相關(guān)，其中，來自NAC、NAC等基因家族的轉(zhuǎn)錄因子，包括FhNAC等轉(zhuǎn)錄因子顯著富集。此外，還發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)與柑橘核細(xì)胞胚發(fā)育密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子FhC2H2，這些基因參與了傷口的愈合、再生和繁殖，研究結(jié)果表明，F(xiàn)hRWP可能是一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)控樞紐，通過調(diào)節(jié)下游轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和影響各種組織來影響植物的再生。

思路發(fā)散

該研究從ATAC-seq入手，先從特異性及差異開放區(qū)域相關(guān)基因中篩選出來部分目的基因，再結(jié)合轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)以及大量基因編輯逐步完善FhRWP調(diào)節(jié)柑橘繁殖中的多效性，與直接從轉(zhuǎn)錄組入手篩選基因相比，初篩的基因范圍可能會(huì)更小，更利于進(jìn)一步鎖定關(guān)鍵基因，為后續(xù)其他研究提供了新的思路。

參考文獻(xiàn)：

Song X, Wang N, Zhou Y, Tian X, Xie Z, Chai L, Wu X, Xu Q, Zhang F, Ye J, Deng X. Adventitious embryonic causal gene FhRWP regulates multiple developmental phenotypes in citrus reproduction. Plant J. 2024 Aug;119(3):1494-1507. doi: 10.1111/tpj.16870. Epub 2024 Jun 16.