空間組學(xué)技術(shù)正在廣泛應(yīng)用腫瘤微環(huán)境分析，高通量高分辨率空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)如何在單細(xì)胞分辨率維度剖析腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞在空間位置上真實(shí)互作？今天小編給大家?guī)?lái)北京大學(xué)第一醫(yī)院的張寧、李航及北京大學(xué)-云南白藥國(guó)際醫(yī)學(xué)中心薛瑞棟團(tuán)隊(duì)合作于2024年5月在Cancer Cell在線發(fā)表題為《Integrative molecular and spatial analysis reveals evolutionary dynamics and tumor-immune interplay of?in situ?and invasive acral melanoma》的研究論文，利用多組學(xué)技術(shù)解析原位肢端型黑色素瘤到侵襲性腫瘤的克隆演變規(guī)律，并高精度揭示了APOE⁺/CD163⁺巨噬細(xì)胞的空間富集狀態(tài)和EMT腫瘤細(xì)胞的互作，發(fā)現(xiàn)APOE和CD163可用于預(yù)測(cè)iAM的預(yù)后，為肢端型黑色素瘤的早期診斷和臨床診療提供了重要依據(jù)。

文章標(biāo)題：Integrative molecular and spatial analysis reveals evolutionary dynamics and tumor-immune interplay of?in situ?and invasive acral melanoma

期刊名稱：Cancer Cell

影響因子：50.3

合作單位：北京大學(xué)第一醫(yī)院、北京大學(xué)-云南白藥國(guó)際醫(yī)學(xué)研究中心

研究方法：全外顯子組、基于顯微切割的多區(qū)域全外顯子測(cè)序、bulk轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、空間轉(zhuǎn)錄組和CODEX空間蛋白組學(xué)

百邁客生物為該研究提供了BMKMANU S1000空間轉(zhuǎn)錄組細(xì)胞分割技術(shù)服務(wù)。

研究背景

肢端型黑色素瘤（acral melanoma, AM）是一種起源于手掌、足底和甲下等部位的惡性皮膚腫瘤，也是亞洲人群中最主要的黑色素瘤亞型，常發(fā)生轉(zhuǎn)移且預(yù)后不佳。原位AM（AM in situ, AMis）經(jīng)手術(shù)切除后極少?gòu)?fù)發(fā)，但侵襲性AM（invasive AM, iAM）的預(yù)后不佳，且PD-1單抗治療響應(yīng)率僅約20%-30%，缺乏有效的治療策略。因此，AMis突破基底膜進(jìn)入真皮發(fā)展為iAM是造成患者預(yù)后變差的重要里程碑事件。然而，目前關(guān)于AMis的研究仍然十分有限，AMis向iAM的演化過(guò)程尚不清楚，免疫微環(huán)境在這一過(guò)程中發(fā)揮的作用也不明確。AM的早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)防可以顯著提高病人預(yù)后和治療。

材料方法

研究材料：

287例肢端型黑色素瘤（AM）患者，146例原位AM（AMis）和141例侵襲性AM（iAM），其中測(cè)序隊(duì)列（147例，其中56例AMis和91例iAM）和驗(yàn)證隊(duì)列（140例，驗(yàn)證所鑒定出的標(biāo)志物和臨床相關(guān)性）。

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：流式分選巨噬細(xì)胞（AM患者腫瘤組織和配對(duì)外周血，n=4）；健康供體外周血單核細(xì)胞和 LM-MEL-45腫瘤細(xì)胞系C.M.共培養(yǎng)（0、3、5、7、10、14天，n=3）；流式分選C3患者和非C3患者EMT腫瘤細(xì)胞（n=4）；APOE⁺/CD163⁺巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)體系（n=3）；LM-MEL-45腫瘤細(xì)胞系：野生型和IGF1R KO，IGF1抑制劑處理（xentuzumab），IGF1R抑制劑處理（linsitinib）

研究方法：

全外顯子組測(cè)序（n=92）、基于顯微切割的多區(qū)域全外顯子測(cè)序（n=33）、bulk轉(zhuǎn)錄組（n=81）、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組（scRNA-seq，n=24）、空間轉(zhuǎn)錄組（BMKMANU S1000，n=10）空間蛋白組學(xué)（CODEX，n=12）。

研究結(jié)果

1.研究隊(duì)列信息和基因組圖譜

為了探究肢端型黑色素瘤的演化規(guī)律及免疫微環(huán)境在其中的作用，研究人員建立了一個(gè)287例患者的隊(duì)列，包含146例AMis和141例iAM，為研究AMis到iAM的演化過(guò)程提供了豐富的資源。研究人員將所有患者分為測(cè)序隊(duì)列（147例）和驗(yàn)證隊(duì)列（140例），測(cè)序隊(duì)列包括56個(gè)AMis患者和91個(gè)iAM患者。

對(duì)測(cè)序隊(duì)列進(jìn)行了多組學(xué)測(cè)序，包括全外顯子組、基于顯微切割的多區(qū)域全外顯子測(cè)序、bulk轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、空間轉(zhuǎn)錄組和CODEX空間蛋白組學(xué)，而驗(yàn)證隊(duì)列用于驗(yàn)證所鑒定出的標(biāo)志物的臨床相關(guān)性。

全外顯子組測(cè)序平均覆蓋度為313X，基因組圖譜顯示本研究隊(duì)列的腫瘤突變負(fù)荷（TMB）與以前的AM研究相比較，高于UM組，低于CM組。本研究數(shù)據(jù)驗(yàn)證了之前報(bào)道22q11.21擴(kuò)增與AM預(yù)后相關(guān)，說(shuō)明了本研究隊(duì)列的高質(zhì)量，能夠?qū)M侵襲進(jìn)行深入分析。

2.AMis和iAM的基因組比較確定了侵襲驅(qū)動(dòng)因素

為了確定AM垂直侵襲的驅(qū)動(dòng)機(jī)制，研究人員首先描繪了AMis和iAM的基因組圖譜，并系統(tǒng)比較了兩者的點(diǎn)突變、拷貝數(shù)變異、突變負(fù)荷、突變印記、亞克隆突變及基因組不穩(wěn)定性。分析結(jié)果表明iAM的亞克隆突變比例和基因組不穩(wěn)定性顯著升高。這種高度的基因組不穩(wěn)定性可能會(huì)加速腫瘤的發(fā)生并有助于獲得侵襲驅(qū)動(dòng)突變。

值得注意的是，研究人員發(fā)現(xiàn)驅(qū)動(dòng)突變（NRAS, KRAS, NF1, KIT）在iAM中顯著富集，并在體外實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了這些驅(qū)動(dòng)突變可以增強(qiáng)肢端型黑色素瘤的侵襲能力。這些結(jié)果表明AM侵襲高度依賴于獲得某些驅(qū)動(dòng)突變，而不是簡(jiǎn)單地積累更多的突變。

AMis和iAM的轉(zhuǎn)錄組學(xué)比較顯示在iAM中富集細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)組織、EMT、KRAS、巨噬細(xì)胞遷移和干擾素γ (IFNγ)?通路，暗示AM侵襲期間TME失調(diào)。總的來(lái)說(shuō)，驅(qū)動(dòng)突變、基因組不穩(wěn)定性和TME改變共同作用有助于AM侵襲。另外，研究人員還發(fā)現(xiàn)附屬器受累也與AMis的驅(qū)動(dòng)突變及侵襲能力密切相關(guān)。

3.早期AM的演化克隆過(guò)程

本文利用LCM技術(shù)探討患者內(nèi)部垂直侵襲和區(qū)域擴(kuò)張的進(jìn)化動(dòng)態(tài)。首先比較了AMis、Syn_AMis和Syn_iAM三種不同類型病變的基因組圖譜，在5例表現(xiàn)出侵襲驅(qū)動(dòng)基因的患者中發(fā)現(xiàn)配對(duì)的Syn-AMis和Syn-iAM共有突變，但是在純AMis中沒(méi)有檢測(cè)到。這個(gè)結(jié)果表明在垂直侵襲之前就已經(jīng)獲得了侵襲驅(qū)動(dòng)突變，進(jìn)一步證實(shí)了它們?cè)贏M侵襲中的驅(qū)動(dòng)作用，這些結(jié)果也證實(shí)之前提到的基因組不穩(wěn)定性有助于AM侵襲。進(jìn)一步探索垂直侵襲起源，研究結(jié)果表明，在垂直侵襲階段，AMis在演化早期獲得驅(qū)動(dòng)突變并迅速穿過(guò)基底膜，以單克隆播散到真皮中。

為了探究區(qū)域擴(kuò)張的演化模式，通過(guò)腫瘤細(xì)胞分?jǐn)?shù)?(CCF)推測(cè)其克隆組成分析發(fā)現(xiàn)不同患者中存在兩種不同的擴(kuò)張模式：（1）CE，克隆擴(kuò)張，即腫瘤細(xì)胞保持單一克隆結(jié)構(gòu)進(jìn)行均質(zhì)擴(kuò)張；（2）SD，亞克隆分化，即腫瘤細(xì)胞在增殖過(guò)程中獲得亞克隆，導(dǎo)致腫瘤異質(zhì)性升高。

4.多組學(xué)分析確定AM三種分子亞型

為了進(jìn)一步了解AM分子亞型，本文利用bulk RNA-seq對(duì)81名患者進(jìn)行檢測(cè)，確定C1、C2、C3三種分子亞型。C1亞型作為“角蛋白”亞型，C2亞型提示“染色質(zhì)重塑”表型，C3亞型表現(xiàn)出“增殖”表型。C3亞型亞克隆突變比例最高，且預(yù)后最差。其中C1和C2是均勻混合AMis和iAM，C3亞型高度富集iAM，表明iAM是一個(gè)獨(dú)特的子集。與非C3 iAM（C1和C2 iAM）相比較，C3 iAM表現(xiàn)為PFS縮短和明顯的惡性現(xiàn)象類型，尤其值得注意的是C3 iAM表現(xiàn)出顯著性更多的亞克隆突變。同時(shí)發(fā)現(xiàn)C3亞型表現(xiàn)出較高水平的免疫浸潤(rùn)、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)和EMT，而通過(guò)這三種AM分子亞型來(lái)看腫瘤負(fù)荷與TAM評(píng)分是相互獨(dú)立的。相比之下，TAM評(píng)分與基因組不穩(wěn)定性相關(guān)，包括wGII和CNH-DNA評(píng)分以及亞克隆突變。此外, TAM評(píng)分與EMT評(píng)分相關(guān)和預(yù)后差。這些結(jié)果共同表明TAM的浸潤(rùn)可能會(huì)促進(jìn)C3的腫瘤EMT和基因組不穩(wěn)定性并導(dǎo)致預(yù)后不良。

5.scRNA-seq鑒定APOE⁺/CD163⁺巨噬細(xì)胞亞群

為了在單細(xì)胞水平研究腫瘤和TME細(xì)胞異質(zhì)性，利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對(duì)8個(gè)AMis?和16個(gè)iAM進(jìn)行檢測(cè)，一共獲得223023個(gè)細(xì)胞，聚類分為13個(gè)細(xì)胞群。并針對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行亞群分析，鑒定5種亞群，包括Mph_APOE_CD163，Mph_APOE, Mph_CD163， Mph_ISG15，和Mph_TIMP1。分析顯示Mph_APOE_CD163、Mph_CD163和Mph_APOE 均為免疫抑制TAM，因此統(tǒng)稱為?APOE⁺/CD163⁺ TAM。研究發(fā)現(xiàn)這類巨噬細(xì)胞在C3亞型中顯著富集，且浸潤(rùn)程度與腫瘤EMT分?jǐn)?shù)正相關(guān)。配體-受體分析表明，巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出最豐富的細(xì)胞間相互作用。

6.空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析證實(shí)了APOE⁺/CD163⁺ TAM與EMT腫瘤細(xì)胞之間的直接接觸和密切相互作用

為了探索APOE⁺/CD163⁺ TAM與EMT高水平的腫瘤細(xì)胞相關(guān)作用，通過(guò)空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（ST，BMKMANU S1000）檢測(cè)10個(gè)AM樣品。結(jié)果可清晰觀察到腫瘤組織多層結(jié)構(gòu)，包括表皮層：基層、棘層和顆粒層、以及分泌汗腺的皮下結(jié)構(gòu)和血管。在C3 iAM患者中，腫瘤區(qū)域富集大量的EMT高水平的腫瘤細(xì)胞，同時(shí)也高度浸潤(rùn)了APOE⁺/CD163⁺ TAM，而在非C3患者中無(wú)法發(fā)現(xiàn)這種共存。正如預(yù)期的那樣，C3患者表現(xiàn)出EMT腫瘤細(xì)胞比例明顯較高，并且APOE⁺/CD163⁺ TAM水平增高。C3患者中，在空間位置上APOE⁺/CD163⁺ TAM更接近EMT腫瘤細(xì)胞。CellChat分析顯示APOE⁺/CD163⁺ TAM作為信號(hào)發(fā)送者(配體)和接收著（受體）均表現(xiàn)出高活性，證實(shí)了其具有細(xì)胞與細(xì)胞強(qiáng)互作。與其他免疫細(xì)胞相比，APOE⁺/CD163⁺ TAM表現(xiàn)出最高水平的胰島素生長(zhǎng)因子(IGF)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的發(fā)送細(xì)胞和接收細(xì)胞，這些結(jié)果揭示APOE⁺/CD163⁺ TAM和EMT腫瘤細(xì)胞在空間上的直接接觸和密切相互作用。

文中如何在空間上實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞分辨率EMT腫瘤細(xì)胞和非EMT腫瘤細(xì)胞的詳細(xì)注釋呢？

研究者利用高分辨空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)結(jié)合細(xì)胞分割方法定位到腫瘤EMT狀態(tài)的細(xì)胞被定義為EMT腫瘤細(xì)胞，而非EMT腫瘤細(xì)胞被映射到其他腫瘤狀態(tài)。

7.多重空間蛋白質(zhì)組學(xué)驗(yàn)證了APOE⁺/CD163⁺ TAM與EMT腫瘤細(xì)胞之間的相互作用

進(jìn)一步驗(yàn)證APOE⁺/CD163⁺?TAM和EMT腫瘤細(xì)胞在蛋白水平上的空間分布和相互作用，文中對(duì)12個(gè)AM樣本進(jìn)行了空間蛋白組檢測(cè)（22 plex CODEX）。其中C3患者以EMT腫瘤區(qū)域?yàn)橹?，非C3患者以非EMT腫瘤區(qū)域?yàn)橹?，結(jié)果表明APOE⁺/CD163⁺ TAM與EMT腫瘤細(xì)胞呈正相關(guān)。在C3患者中，IGF1和IGF1R的表達(dá)水平均顯著升高。APOE⁺/CD163⁺ TAM高度富集在EMT^high區(qū)域。同時(shí)IGF1和IGF1R在EMT^high區(qū)域也顯著升高。這些結(jié)果在單細(xì)胞水平和空間水平均支持APOE⁺/CD163^+?TAM可能通過(guò)IGF1-IGF1R相互作用促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的EMT。

8.實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證APOE⁺/CD163⁺ TAM通過(guò)IGF1-IGF1R相互作用促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的EMT

流式分選患者腫瘤組織和配對(duì)外周血APOE⁺/CD163⁺ TAM，蛋白水平可以檢測(cè)到APOE⁺/CD163⁺ TAM的表達(dá)，同時(shí)AM細(xì)胞可以誘導(dǎo)APOE⁺/CD163⁺ TAM表型。離體分析證實(shí)C3患者的EMT腫瘤細(xì)胞的比例明顯高于非C3患者，ELISA分析顯示，與APOE⁺/CD163⁺ TAM共培養(yǎng)后，IGF1蛋白的分泌持續(xù)升高，而IGF1抑制劑、IGF1R抑制劑及敲除腫瘤的IGF1R均可以抑制這一過(guò)程，這些結(jié)果表明APOE⁺/CD163⁺ TAM可以通過(guò)IGF1-IGF1R相互作用促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的EMT。研究人員還在兩個(gè)獨(dú)立隊(duì)列中驗(yàn)證了APOE和CD163染色可用于預(yù)測(cè)AM的預(yù)后。

研究總結(jié)

綜上所述，本研究基于多組學(xué)測(cè)序，系統(tǒng)揭示了早期肢端型黑色素瘤的克隆演化規(guī)律，建立了肢端型黑色素瘤的分子分型，解析了腫瘤細(xì)胞-免疫細(xì)胞的空間互作關(guān)系，鑒定出新的早期診斷標(biāo)志物（驅(qū)動(dòng)突變和附屬器受累）及晚期預(yù)后標(biāo)志物（APOE和CD163），為肢端型黑色素瘤的早期診斷和精準(zhǔn)診療提供了重要信息。

北京大學(xué)第一醫(yī)院的張寧教授、李航教授和北京大學(xué)-云南白藥國(guó)際醫(yī)學(xué)研究中心的薛瑞棟研究員（北京大學(xué)第一醫(yī)院兼職教授）為共同通訊作者。北京大學(xué)-云南白藥國(guó)際醫(yī)學(xué)研究中心劉恒康博士后、北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科高嘉雯博士和北京大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤轉(zhuǎn)化研究中心馮梅博士后為共同第一作者。

參考文獻(xiàn)：

Liu et al., Integrative molecular and spatial analysis reveals evolutionary dynamics and tumor-immune interplay of?in situ?and invasive acral melanoma,?Cancer Cell?(2024), https://doi.org/10.1016/j.ccell.2024.04.012

百創(chuàng)S3000?3.5μm?極致提升空間檢測(cè)深度和精度

基于空間組學(xué)快速發(fā)展，百邁客自主創(chuàng)新單細(xì)胞分辨率空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)（S1000、S2000、S3000），開(kāi)創(chuàng)原片無(wú)錯(cuò)高清H&E+原片無(wú)錯(cuò)熒光+原片測(cè)序，“三片合一”實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的細(xì)胞分割，將空間轉(zhuǎn)錄組推進(jìn)到真實(shí)單細(xì)胞分辨率的領(lǐng)域。

經(jīng)過(guò)不斷打磨，百創(chuàng)智造于2024年3月27日在山東青島正式發(fā)布了百創(chuàng)S3000空間轉(zhuǎn)錄組芯片，性能全面升級(jí)，極致提升空間組學(xué)檢測(cè)的深度和精度。

百創(chuàng)S3000在6.8mm*6.8mm 的捕獲區(qū)域內(nèi)鋪設(shè)了4,144,770個(gè)捕獲位點(diǎn)，相鄰兩個(gè)捕獲位點(diǎn)的中心距為3.5μm。

相較于現(xiàn)在廣受市場(chǎng)認(rèn)可與好評(píng)的百創(chuàng)S1000轉(zhuǎn)錄組芯片，捕獲位點(diǎn)數(shù)提升近2倍，分辨率同樣提升近2倍。

在相同的測(cè)序飽和度下，單細(xì)胞級(jí)別分辨率下中位UMI提升了30%~70%，中位基因數(shù)提升30%-60%。