期刊名稱：Plant Biotechnology Journal

影響因子：13.263

合作單位：海軍軍醫(yī)大學(xué)

研究部位：丹參根、莖、葉、花

研究方法：代謝組學(xué)、體外酶活、分子對(duì)接等

研究背景

2024年1月16日，海軍軍醫(yī)大學(xué)陳萬生與張磊團(tuán)隊(duì)合作在植物學(xué)領(lǐng)域國際一流學(xué)術(shù)期刊《植物生物技術(shù)》Plant Biotechnology Journal發(fā)表一項(xiàng)最新研究成果，題為：Versatile CYP98A enzymes catalyse meta-hydroxylation reveals diversity of salvianolic acids biosynthesis。本研究以富含丹酚酸的代表性重要藥用植物丹參為研究對(duì)象，闡明了丹酚酸生物合成的多樣性，為CYP98A酶在間位羥基化反應(yīng)中催化特異性的通用性提供了新的見解，同時(shí)也證明CYP98A酶是利用代謝工程策略提高丹酚酸含量的理想操作靶點(diǎn)。中藥丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根和根莖，是我國常用中藥。丹參藥用歷史悠久，始載于中國傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)典籍《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有祛疲止痛、活血通經(jīng)、清心除煩之功效。丹參作為復(fù)方丹參滴丸、復(fù)方丹參片、丹紅注射液等藥物的原料，廣泛應(yīng)用于心、腦血管疾病的治療，丹參藥材的年使用量超萬噸，屬于大宗常用中藥材。丹參有效成分主要包括脂溶性的丹參酮類化合物和水溶性的丹酚酸類化合物。

實(shí)驗(yàn)材料

本研究中使用的是具有穩(wěn)定的RA和SAB含量的S.?miltiorrhiza f.alba，由中國科學(xué)院植物研究所贈(zèng)送。

物質(zhì)簡稱

丹參酸（SA）、迷迭香酸（RA）、丹參素（DSS）和丹酚酸B（SAB）；迷迭香酸合酶（RAS）

研究結(jié)果

1.代謝組分析——驗(yàn)證唇形科和紫草科植物SA生物合成途徑的喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

丹參中酪氨酸衍生的途徑從未被報(bào)道過，丹參素（DSS）是否參與SA生物合成仍然未知。SA的生物合成可能是多樣化的，作者在同位素標(biāo)記的喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)去驗(yàn)證這一結(jié)論。含有同位素標(biāo)記的 L-苯丙氨酸和 L-酪氨酸浸潤3個(gè)月大的丹參葉子中。從不同時(shí)間點(diǎn)收集的葉片中提取SA，并使用UPLC-Q-TOF/MS進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，在p-CA、CA、4-HPL、DSS、SAB和RA及其前體（包括4C-4′-HPL、4C-3′、4′-DHPL和Ca-4′-HPL）均被檢測出標(biāo)記（圖1b）。這些結(jié)果驗(yàn)證了作者的推測，即不同的?；w，包括4C-CoA和CA-CoA以及含有4-HPL和DSS的?；荏w參與SA的形成。SA的生物合成途徑是多種多樣的。

2.基因分析——SmCYP98A酶在丹參中的特性

從SmCYP98A亞家族中鑒定出4種酶，分別是SmCYP98A75、SmCYP98A76、SmCYP98A77和SmCYP98A14。SmCYP98A家族酶能催化羥基肉桂酸酯的間羥基化形成RA，說明它們屬于4-香豆酰酯3-羥化酶（C3H）家族。通過鄰連接樹（NJ樹）分析，SmCYP98A酶與C3H之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系（圖2a）。結(jié)果表明，SmCYP98A75與SmCYP98A14和CbCYP98A14具有更顯著的序列同源性。而SmCYP98A77與其他CYP98A成員同源性較低。四種SmCYP98A 酶的氨基酸序列包含 P450 單加氧酶的幾個(gè)特征基序，例如 PERF 基序、血紅素結(jié)合半胱氨酸基序和含蘇氨酸的結(jié)合口袋（圖2b）。

為了分析4種SmCYP98A酶在丹參中的表達(dá)譜，收集了來自不同器官的組織，包括根、莖、葉和花。結(jié)果表明，兩個(gè)基因均在所有器官中均有表達(dá)，且SmCYP98A75在花和葉中的表達(dá)水平較高，SmCYP98A76的在莖中表達(dá)較高，SmCYP98A7在花和葉中含量高，SmCYP98A14在根含量高（圖2c）。SA主要在葉和根中積累，SmCYP98A酶在這兩個(gè)器官中的高表達(dá)水平表明它們可能參與SA的生物合成。

3.體外酶活實(shí)驗(yàn)——SmRAS催化RA形成的前體

在富含SA的植株中測定了4C-4′-HPL、4C-3′-DHPL和Ca-4′-HPL等幾種酰基供體和受體及其酯形成產(chǎn)物，表明RAS可能在RA及其前體的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，作者接下來驗(yàn)證SmRAS在催化不同酰基供體和受體中的催化活性功能。體外異源表達(dá)SmRAS蛋白，并與?；o酶 A 供體（4C-CoA 和 Ca-CoA）和酰基受體底物（4-HPL 和 DSS）一起孵育，這些底物存在于丹參的迷迭香酸生物合成中。采用UPLC-Q-TOF/MS檢測反應(yīng)混合物，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析。結(jié)果表明，SmRAS與4-HPL和DSS催化4C-CoA和Ca-CoA，形成4C-4′-HPL、4C-3′、4′-DHPL、Ca-4′-HPL和RA（圖3a、d）。

4.體外酶活實(shí)驗(yàn)——SmCYP98A75和SmCYP98A14參與RA的生物合成

將SmCYP98A75、Sm CYP98A76、Sm CYP98A77 和 SmCYP98A14共轉(zhuǎn)化到酵母中，對(duì)4C-4′-HPL、4C-3′，4′-DHPL和Ca-4′-HPL三種底物進(jìn)行表征試驗(yàn)。使用UPLC-Q-TOF/MS分析產(chǎn)物。結(jié)果表明，SmCYP98A75可以將4C-4′-HPL轉(zhuǎn)化為4C-3′，4′-DHPL和Ca-4′-HPL轉(zhuǎn)化為RA，表明SmCYP98A75催化了?；荏w衍生酚環(huán)的C-3′羥基化。SmCYP98A14可以催化4C-4′-HPL為Ca-4′-HPL，4C-3′，4′-DHPL為RA，然而，它不能直接將4C-4′-HPL轉(zhuǎn)化為RA，表明SmCYP98A14催化酰基供體芳香環(huán)的C-3羥基化。此外，當(dāng)反應(yīng)體系中存在SmCYP98A75和Sm CYP98A14時(shí)，4C-4′-HPL 被催化為RA，表明Sm CYP98A75和SmCYP98A14參與RA的生物合成（圖 3b、e）。此外，SmCYP98A76和SmCYP98A77在上述催化反應(yīng)中缺乏活性。

5.體外酶活實(shí)驗(yàn)——CYP98A75參與DSS的生物合成

上述研究表明SmCYP98A75負(fù)責(zé)RA生物合成中酰基受體部分的 C-3′羥基化，因此作者推測SmCYP98A 酶可能在丹參素DSS形成中發(fā)揮重要作用。體外酶活實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)SmCYP98A75或SmCYP98A14與4-HPL一起孵育時(shí)，在產(chǎn)物中檢測到4-HPPA，說明這兩種酶表現(xiàn)出將4-HPL的側(cè)鏈羥基直接氧化為酮的能力。然而，在兩個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)中均未檢測到DSS。作者認(rèn)為植物內(nèi)部生物合成環(huán)境是復(fù)雜的，包括許多代謝途徑和催化酶，在反應(yīng)體系中加入?；w和SmRAS，以模擬丹參的DSS生物合成。與SmRAS和4C-CoA或Ca-CoA孵育后，僅在SmCYP98A75催化的反應(yīng)中產(chǎn)生DSS（圖3c，f）。

6.轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)——SmCYP98A75和SmCYP98A14在丹參中的體內(nèi)功能

為了進(jìn)一步研究SmCYP98A75和SmCYP98A14在SA生物合成中的作用，作者利用CRISPR/Cas9技術(shù)生成了SmCYP98A75和SmCYP98A14單突變體和雙突變體。純合突變體用于分析SA積累（圖4a，b）。與WT相比，突變體顯示出更低的SA積累。SmCYP98A75 和SmCYP98A14 突變體的DSS、RA和SAB水平降低，尤其是SmCYP98A75突變體中幾乎檢測不到DSS。與WT相比，雙突變體中DSS和RA幾乎檢測不到，表明CYP98A成員在SA生物合成中都起著重要作用（圖4c-e）。進(jìn)一步檢測SA生物合成途徑中關(guān)鍵酶的表達(dá)水平，包括SmPAL、SmC4H、Sm4CL、SmTAT、SmHPPR和SmRAS在突變體毛根中的表達(dá)。結(jié)果表明，與WT相比，SmCYP98A75 和SmCYP98A14單突變系和雙突變系中SmPAL、SmC4H、SmTAT和SmRAS 的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低。

進(jìn)一步超量表達(dá)SmCYP98A7 或SmCYP98A14基因。過表達(dá)材料表現(xiàn)出更高的SA、DSS、RA和SAB積累，表明這些酶可能參與了增加SA含量的代謝調(diào)節(jié)（圖4f，g）。RT-qPCR驗(yàn)證了過表達(dá)材料中SmCYP98A75、SmCYP98A14和SA生物合成途徑中關(guān)鍵酶的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與WT相比，SmCYP98A75 和SmCYP98A14過表達(dá)材料中SmPAL、SmC4H、SmTAT 和SmRAS的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高。

7.亞細(xì)胞定位分析——SmCYP98A75和SmCYP98A14的亞細(xì)胞定位

為研究SmCYP98A75和SmCYP98A14在亞細(xì)胞水平上的定位模式，構(gòu)建了SmCYP98A75-GFP和SmCYP98A14-GFP融合蛋白，并在本式煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)。結(jié)果表明，在細(xì)胞膜和線粒體中觀察到SmCYP98A75-GFP和SmCYP98A14-GFP融合蛋白的熒光信號(hào)，與CYP蛋白定位特征一致。此外，CbCYP98A14-GFP的定位模式與兩種SmCYP98A酶一致。

8.基因結(jié)構(gòu)與基因?qū)臃治觥猄mCYP98A75和SmCYP98A14中的結(jié)構(gòu)識(shí)別

SmCYP98A75和SmCYP9814底物特異性的差異為研究底物識(shí)別和代謝的結(jié)構(gòu)特征提供了機(jī)會(huì)。使用在線SWISS-MODEL進(jìn)行同源建模。SmCYP98A75和SmCYP98A14的整體結(jié)構(gòu)模型高度相似，表明兩種SmCYP98A的底物識(shí)別和代謝是保守的。SmCYP98A75的整體結(jié)構(gòu)模型包含22個(gè)α螺旋和8個(gè)β鏈，SmCYP98A14的整體結(jié)構(gòu)模型包含20個(gè)α螺旋和6個(gè)β鏈，與 SmCYP98A14 高度相似（圖5a）。在結(jié)構(gòu)模型中觀察到血紅素分子與兩個(gè) SmCYP98A 的活性結(jié)合口袋。通過與口袋內(nèi)殘基的多次相互作用，它被穩(wěn)定在正確的位置。兩種SmCYP98A和CbCYP98A14的血紅素包圍基序和關(guān)鍵催化氨基酸是高度保守的（圖5b）?；谂c已知 P450 的疊加，通道 1 可能容納底物進(jìn)入和產(chǎn)物，而通道 2 可能使血紅素能夠進(jìn)入水和質(zhì)子。

SmCYP98A75和SmCYP98A14分別催化RA芳環(huán)的 C-3′和C-3羥基化。此外，DSS僅在SmCYP98A75的反應(yīng)體系中檢測到，而在SmCYP98A14的反應(yīng)體系中未檢測到。為了探究兩種SmCYP98A選擇性的潛在分子機(jī)制，進(jìn)行了分子對(duì)接。觀察到Ca-4′-HPL分子與SmCYP98A75的活性口袋結(jié)合。通過與口袋中的關(guān)鍵殘基 His391、Glu224、Trp113 和 Ala300 的多次相互作用，將其穩(wěn)定在正確的位置（圖 5c）。SmCYP98A14活性口袋與4C-3′，4′-DHPL 分子結(jié)合，并通過與口袋中殘基 Asp301、Thr302、Ala297、Ser100 和 Lys103 的多次相互作用穩(wěn)定（圖 5d）。在CYP的多序列比對(duì)中，具有關(guān)鍵殘基的區(qū)域高度保守，這反過來表明這些區(qū)域與底物識(shí)別相關(guān)（圖5e）。此外，Glu224（Sm CYP98A75）、Ser100 和 Lys103（SmCYP98A14）定位的兩個(gè)關(guān)鍵基序被鑒定為底物選擇和結(jié)合區(qū)域（SbC4H1 中的F/G 環(huán)）。SmCYP98A14和CbCYP98A14中兩個(gè)關(guān)鍵基序的殘基幾乎相似，這表明這兩種蛋白質(zhì)可能具有相同的底物選擇偏好（圖 5e）。與殘基Thr301、Ala 297、Trp113、Ala101等多次相互作用，穩(wěn)定了SmCYP98A14活性口袋中的4C-4′-HPL和4C-3′，4′-DHPL分子。

研究總結(jié)

在多種食品和醫(yī)療行業(yè)應(yīng)用中顯示出巨大的潛力，這推動(dòng)了全球?qū)A一代的關(guān)注。SA的生物合成途徑已在多個(gè)物種中報(bào)道，幾乎所有研究都認(rèn)為只有一個(gè)?；w和受體參與SA的形成。本研究研究強(qiáng)調(diào)，各種?；w和受體參與酯形成反應(yīng)，CYP98A酶負(fù)責(zé)SA生物合成中的不同間羥基化。在這里，以S. miltiorrhiza為例，闡明SA生物合成的多樣性（圖6）。這些研究大大加深了對(duì)酚酸生物合成途徑中SA的理解，并增強(qiáng)了我們克服具有多種藥理活性的工程復(fù)合SA的合成生物學(xué)挑戰(zhàn)的能力。