研究背景

前列腺癌高度的瘤內(nèi)異質(zhì)性和復(fù)雜的細(xì)胞起源極大地限制了傳統(tǒng)的RNA測序在疾病診斷和分層中尋找更好的生物標(biāo)志物方面的效用?；诮M織標(biāo)本的單細(xì)胞RNA測序在識別新的生物標(biāo)志物方面具有很大的前景，但是這項技術(shù)還未被用于前列腺癌異質(zhì)性的研究。

實驗方法

采用單細(xì)胞RNA測序法鑒定細(xì)胞類型及相應(yīng)的標(biāo)記基因，通過拷貝數(shù)變異分析和偽混池測序的差異表達(dá)基因分析對不同聚類的惡性程度進(jìn)行評價。通過標(biāo)記基因的ROC曲線來評估前列腺癌的診斷和分層。免疫組化證實了標(biāo)記基因的表達(dá)特征。

實驗結(jié)果

一、PCa的scRNA序列分析和細(xì)胞分型

兩名患者通過前列腺組織中AMACR的過度表達(dá)和TP63的缺失表達(dá)被診斷為PCa。收集兩名患者的癌樣，解剖并消化成單個細(xì)胞，用10×基因組學(xué)進(jìn)行scRNA-seq（圖1a）。共有7904個合格細(xì)胞用于進(jìn)一步分析。通過PCA對所有細(xì)胞進(jìn)行無偏聚類，UMAP可視化細(xì)胞成分（圖1b）。通過DEG分析確定了15個主要簇的特征基因：T細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、1型管腔細(xì)胞、2型管腔細(xì)胞、紅細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、3型管腔細(xì)胞、肥大細(xì)胞、基底細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、B細(xì)胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞（圖1c）。

Fig1 通過單細(xì)胞測序鑒定PCa中不同的細(xì)胞類型。

在本文的數(shù)據(jù)中，根據(jù)管腔標(biāo)志物在PCa樣本中的高表達(dá)水平，確定了3種類型的管腔細(xì)胞，包括角蛋白8（KRT8）和角蛋白18（KRT18）。為了表征這些管腔簇，作者用VlnPlot和FeaturePlot分別檢測了各自標(biāo)記基因的表達(dá)模式。結(jié)果表明，這些溶解酶（k4a）可作為特異性的載體（k4a）表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)（k4a4）。銅藍(lán)蛋白（CP）在2型管腔細(xì)胞中唯一表達(dá)，而細(xì)胞維甲酸結(jié)合蛋白2（CRABP2）在間充質(zhì)細(xì)胞以及2型和3型管腔細(xì)胞中高表達(dá)，這表明CP更適合2型管腔細(xì)胞（圖2a，b）。與其他簇相比，3型管腔細(xì)胞表現(xiàn)出更高水平的β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1（B4GALT1）和干擾素α誘導(dǎo)蛋白6（IFI6）的表達(dá)水平，表明B4GALT1和IFI6可以識別這些細(xì)胞（圖2a，b）。為了研究PCa組織中每種類型管腔細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)定位，我們使用抗SLC45A3、抗CP、抗B4GALT1抗體進(jìn)行免疫染色，并用DAPI復(fù)染組織切片（圖2c）。SLC45A3在前列腺組織的大多數(shù)管腔細(xì)胞中表達(dá)（圖2c）。相反，在一小部分管腔細(xì)胞中檢測到低表達(dá)水平的SLC45A3（圖2c）。不同類型的癌細(xì)胞在T1區(qū)的發(fā)育不完全相同（圖2 c）。

Fig2 應(yīng)用scRNA-seq分析和免疫組化檢測PCa組織中不同管腔簇特異性標(biāo)記基因的表達(dá)水平。

二、PCa中惡性管腔細(xì)胞的鑒定

為了評估已識別管腔簇的惡性程度，根據(jù)基因組間隔的平均表達(dá)模式對每種細(xì)胞類型的CNV水平進(jìn)行分析。大多數(shù)非管腔細(xì)胞顯示極低的CNV水平，除了紅細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，它們呈現(xiàn)中等CNV水平。

作者用edgeR軟件包進(jìn)一步檢測了這些細(xì)胞的基因表達(dá)模式。1型管腔細(xì)胞顯示PCa標(biāo)記物（包括FOLH1、KLK3和神經(jīng)肽Y（NPY）的表達(dá)水平更高。相反，2型管腔細(xì)胞表現(xiàn)出PCa抑制相關(guān)基因Latexin（LXN）和分泌性白細(xì)胞肽酶抑制劑（SLPI）的高表達(dá)，這些基因的缺失通常在PCa中檢測到，并且與PCa患者的陰性預(yù)后相關(guān)。然而，前向梯度2（AGR2）是PCa的尿標(biāo)志物，也在2型管腔細(xì)胞中高表達(dá)，表明2型管腔細(xì)胞并非完全正常細(xì)胞。3型管腔細(xì)胞表現(xiàn)出C-C基序趨化因子配體3（CCL3）、C-X-C基序趨化因子配體1（CXCL1）和Dickkopf-WNT信號通路抑制物1（DKK1）的高表達(dá)，這些細(xì)胞在PCa中的表達(dá)水平增加，并與骨轉(zhuǎn)移和PCa的侵襲性有關(guān)。綜上所述，1型和3型管腔細(xì)胞簇是由在PCa發(fā)生和發(fā)展中起不同作用的惡性細(xì)胞組成，而2型管腔細(xì)胞則是正常的前列腺上皮細(xì)胞。

Fig3 每個管腔團(tuán)簇的DEGs和富集過程

為了進(jìn)一步確定每個管腔簇在PCa發(fā)生和發(fā)展中的潛在作用，作者進(jìn)行了功能增強。1型管腔細(xì)胞上調(diào)的基因主要富集于參與癌癥進(jìn)展的代謝過程，如脂肪酸代謝過程、甾體生物合成過程和肽類激素分泌，表明1型管腔細(xì)胞確實是惡性細(xì)胞（圖3a，d）。2型細(xì)胞中蛋白水解酶和胞漿蛋白水解活性均為陽性，提示細(xì)胞內(nèi)蛋白水解活性和2型細(xì)胞的高表達(dá)有關(guān)。有趣的是，2型管腔細(xì)胞中其他高表達(dá)的基因在正常前列腺發(fā)育過程中豐富，包括表皮發(fā)育、表皮細(xì)胞分化和對類固醇激素的反應(yīng)（圖3b，e）。綜合起來，2型管腔細(xì)胞被鑒定為惡性程度相對較低的細(xì)胞。為了進(jìn)一步驗證這一觀點，我們對從成對比較中獲得的每個亮度DEG進(jìn)行GO分析，并得到類似的結(jié)果。在3型管腔細(xì)胞中表達(dá)的上調(diào)基因主要參與腫瘤遷移相關(guān)的過程，如血管生成、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換的正調(diào)控和內(nèi)皮細(xì)胞的發(fā)育，表明3型管腔細(xì)胞也是惡性細(xì)胞（圖3c，f）。

三、PCa上皮細(xì)胞在腫瘤進(jìn)展過程中的擬時間軌跡分析

PCa通常以管腔細(xì)胞擴張和基底細(xì)胞丟失為特征，因此認(rèn)為管腔細(xì)胞是PCa中腫瘤細(xì)胞的起源。有研究證明來源可能并非來自管腔細(xì)胞，因為原發(fā)性良性前列腺組織的基底細(xì)胞可誘導(dǎo)免疫缺陷小鼠前列腺腫瘤的發(fā)生。為探討PCa腫瘤發(fā)生過程中腫瘤細(xì)胞的來源，采用擬時間軌跡分析法。

Fig4 利用基底細(xì)胞和管腔細(xì)胞重建癌細(xì)胞的假時間軌跡，并識別在該軌跡中變化的基因。

進(jìn)一步用基底細(xì)胞和3種管腔細(xì)胞進(jìn)行檢測?；准?xì)胞和2型管腔細(xì)胞顯示在軌跡的開始（圖4a，b）。3型管腔細(xì)胞出現(xiàn)在軌跡分支1的末端，1型管腔細(xì)胞出現(xiàn)在軌跡分支2的兩端（圖4a，b）。這些結(jié)果表明基底細(xì)胞和2型管腔細(xì)胞都可能是PCa的始發(fā)細(xì)胞，并可能在PCa的發(fā)展過程中轉(zhuǎn)化為2種不同類型的惡性管腔細(xì)胞。

作者進(jìn)一步分析了基因沿軌跡的動態(tài)表達(dá)變化，以確定PCa進(jìn)展的關(guān)鍵基因。表達(dá)變化最顯著的基因包括：酸性磷酸酶、前列腺（ACPP）、激肽釋放酶相關(guān)肽酶2（KLK2）、KLK3、角蛋白15（KRT15）、基質(zhì)金屬肽酶7（MMP7）和NPY（圖4c）。此外，作者對前100個基因進(jìn)行了擬時間表達(dá)模式的聚類分析，并分析了每個簇的功能豐富程度。聚類1中的基因高度表達(dá)于終末期，主要富集于PCa起始和進(jìn)展相關(guān)的過程，包括細(xì)胞修飾的氨基酸代謝過程、激素分泌和AR信號通路（圖4d）。第二類基因在前列腺發(fā)育初期表現(xiàn)出高表達(dá)水平，主要參與表皮發(fā)育和表皮細(xì)胞分化，提示其在前列腺正常發(fā)育中的潛在作用（圖4d）。聚類3中的大多數(shù)基因在假時間軌跡的中間階段表達(dá)增加，并在細(xì)胞趨化性中富集（圖4d）。

四、PCa中惡性管腔細(xì)胞亞群的研究

作者首先分析來自TCGA的公共PCa患者中每個管腔標(biāo)志基因的表達(dá)水平，以檢驗它們與PCa發(fā)生和發(fā)展的臨床相關(guān)性。相比之下，大多數(shù)1型管腔標(biāo)記基因在惡性程度較低的前列腺癌中的表達(dá)高于惡性程度高或正常前列腺，這表明在前列腺癌的發(fā)生和早期發(fā)展中有潛在的作用（補充圖5）。因此，作者對1型管腔細(xì)胞進(jìn)行了亞聚類，以確定引起PCa的亞群。PCA將1型管腔細(xì)胞分為5個亞組（圖5a，b）。分析每個亞組標(biāo)記基因的功能富集，亞組1與腫瘤細(xì)胞有絲分裂準(zhǔn)備所必需的生物分子代謝過程有關(guān)，如脂質(zhì)代謝過程和有機酸代謝過程（圖5c）。與其他亞組相比，亞組2與細(xì)胞運動、管形態(tài)發(fā)生和細(xì)胞死亡負(fù)調(diào)控有關(guān)，這些過程對腫瘤的遷移和生長至關(guān)重要（圖5c）。亞組3主要參與G蛋白偶聯(lián)受體信號通路和肌肉組織發(fā)育（圖5c）。第4亞組與PCa相關(guān)的過程，包括激素水平的調(diào)節(jié)，激素轉(zhuǎn)運和肽激素轉(zhuǎn)錄（圖5c）。相比之下，第5亞群的獨特功能主要集中在細(xì)胞生長（圖5c）。VlnPlot和特征圖顯示，AMACR、甘氨酸鈉基轉(zhuǎn)移酶樣1（GLYATL1）和PCA3在5亞組中特異表達(dá)（圖5d，e）。有趣的是，AMACR是一種在前列腺癌中高度表達(dá)的過氧化物酶體酶，參與支鏈脂肪酸和膽汁酸中間產(chǎn)物的β-氧化，對PCa的發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要。PCA3是一種非編碼RNA，在PCa細(xì)胞系、原發(fā)組織甚至PCa患者尿液中高表達(dá)。這兩個5亞組的標(biāo)記物已經(jīng)被用于PCa的診斷和分層，這意味著5亞組可能是臨床上PCa診斷和分層所必需的一組不同的細(xì)胞。

Fig5 PCA對1型管腔細(xì)胞亞群進(jìn)行亞群聚類。

五、Ⅰ型管腔細(xì)胞的5亞群是PCa診斷和分層的關(guān)鍵

分析TCGA患者Ⅰ型管腔亞群的臨床相關(guān)性及其標(biāo)記基因的表達(dá)模式。正常前列腺中大多數(shù)1-4亞組標(biāo)記基因的表達(dá)水平與PCa組織中的相似甚至更高。相比之下，第5亞組的標(biāo)記基因在PCa組織中高表達(dá)，尤其是在Gleason評分為6或7的患者中，這表明在PCa的發(fā)生和早期發(fā)展中有潛在的作用（圖6a）。通過ROC分析，我們進(jìn)一步鑒定了5亞組中6個特異性和敏感性最高的標(biāo)記基因，包括AMACR、GLYATL1、HPN、前列腺癌基因PCA3，前列腺癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄物18（PCAT18）和磷脂酶A2第七組（PLA2G7）（圖6b）?；?-基因集的ROC分析顯示了很強的PCa預(yù)測能力，AUC得分為0.937。此外，這些基因的表達(dá)模式不僅區(qū)分了PCa與正常前列腺，而且區(qū)分了早期PCa（Gleason評分=6）和高度惡性PCa（Gleason評分≥8）。許多PCa患者在1-2年內(nèi)表現(xiàn)出抗藥性，并復(fù)發(fā)為晚期PCa，如CRPC。第5亞組可能有助于PCa復(fù)發(fā)。然而，Kaplan-Meier分析顯示，這些基因在生化復(fù)發(fā)中沒有明顯的預(yù)測能力，無論是單獨的還是作為一個基因集（圖6c）?？傊?亞組的惡性細(xì)胞是PCa診斷和分層的關(guān)鍵，但與生化復(fù)發(fā)無關(guān)。

Fig6 第5亞組與PCa診斷和分層的臨床相關(guān)性。

不同病理分級的癌組織之間（圖7a）。為了檢驗強度差異作者進(jìn)一步用Hscore分析免疫染色評分，發(fā)現(xiàn)HPN在癌組織中的表達(dá)水平顯著增強（圖7b）。此外，高病理分級（Gleason評分=7,8,9）的腫瘤組織中HPN的表達(dá)水平顯著高于病理分級較低（Gleason評分=6）（圖7c）。因此，作者認(rèn)為HPN可能是臨床PCa診斷和分層更為特異、敏感的生物標(biāo)志物。為了探討HPN在預(yù)測PCa復(fù)發(fā)中的作用，作者根據(jù)HPN的表達(dá)水平將TCGA患者分為低和高兩組，然后分析了治療依從性標(biāo)記物的表達(dá)，包括ATP結(jié)合盒亞家族G成員2（ABCG2）、醛脫氫酶1（ALDH1）、受體酪氨酸激酶（KIT）的表達(dá)，活化白細(xì)胞粘附分子。

Fig7 PCa組織陣列中HPN表達(dá)的驗證

結(jié)論

本文案例是第一個通過原發(fā)性PCa組織的scRNA序列檢測PCa異質(zhì)性的報告。PCa組織由3種不同類型的管腔細(xì)胞組成，它們在PCa的發(fā)生和發(fā)展中具有不同的作用。對PCa診斷和分層至關(guān)重要的管腔細(xì)胞亞群及其標(biāo)記基因HPN被鑒定。這項研究結(jié)果不僅有助于目前對PCa發(fā)生和發(fā)展的理解，而且對PCa診斷和分層的標(biāo)記物的鑒定應(yīng)用具有潛在的價值。