被廣泛應(yīng)用于遺傳基因定位的另一種方法，BSA，也可有效解析質(zhì)量與數(shù)量性狀。高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展使BSA在基因定位中發(fā)揮著巨大潛力，例如，MutMap，SHOREmap與MMAPPR在質(zhì)量性狀定位中可取代傳統(tǒng)的圖位克隆。對(duì)于數(shù)量性狀，可利用QTL-seq定位QTLs，但定位區(qū)間較大很難識(shí)別候選基因，所以非常需要一種新的方法，用于快速定位數(shù)量性狀候選基因。

介于上述種種定位方法的局限性，本文介紹一種新的方法——QTG-Seq，即通過(guò)QTL分離（即，將數(shù)量性狀轉(zhuǎn)化為質(zhì)量性狀），極端表型混池，高通量測(cè)序以及新算法挖掘候選基因。這一方法是由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)李林課題組、章元明課題組與中國(guó)農(nóng)科院王國(guó)英課題組開發(fā)并應(yīng)用成功，最后以“QTG-seq accelerates QTL fine mapping through QTL partitioning and whole-genome sequencing on bulked segregant samples”為題，在線發(fā)表在Molecular Plant上。

QTG-Seq基本原理（流程如下）——

（1）群體構(gòu)建：?F1，?F2，?BC1F1群體

（2）QTL定位：F2群體定位QTL，F(xiàn)2:3家系證明QTL定位結(jié)果

（3）QTL分離：分子標(biāo)記篩選目標(biāo)QTL雜合，其它QTL純合的BC1F1單株（BC1F1數(shù)目要充足）；然后自交得到BC1F1:2家系

（4）極端表型選擇：從BC1F1:2中選2個(gè)極端表型組（前20%，后20%，至少1000個(gè)單株）

（5）極端表型混池：提取DNA并混池，形成2個(gè)極端池

（6）測(cè)序并變異calling：對(duì)兩個(gè)混池測(cè)序，與參考基因組比對(duì)分析變異

（7）關(guān)聯(lián)分析：新方法smoothLOD（準(zhǔn)確關(guān)聯(lián)靶標(biāo)位點(diǎn)），結(jié)合其他方法，如ED（Hill et al., 2013）與G’（Magwene et al., 2011）（關(guān)聯(lián)peak位置）

?圖1.?QTG-Seq基本原理

應(yīng)用——QTG-Seq快速定位玉米株高QTL，qPH7

以玉米株高為模式性狀展開QTG-seq研究：利用4代玉米群體材料，通過(guò)QTL-seq精細(xì)定位株高主效QTL，這與傳統(tǒng)QTL精細(xì)定位用到許多代創(chuàng)制高世代回交群體明顯不同。首先，利用株高差異明顯的兩個(gè)自交系HZS與1462，構(gòu)建F2分離群體，個(gè)體株高變化范圍為199cm~307 cm，呈超親分離的現(xiàn)象，暗示株高是由多個(gè)QTLs控制；然后，利用1028個(gè)多態(tài)性標(biāo)記定位主效QTLs，結(jié)果定位到4個(gè)QTL（位于Chr.1,3,6,7），PVE介于7%-17%，又利用F2:3家系驗(yàn)證QTL定位結(jié)果可靠；最后，選擇Chr7.上的QTL?qPH7利用QTL-seq策略進(jìn)行精細(xì)定位。

利用12個(gè)標(biāo)記篩選出813個(gè)BC1F1單株（qPH7位點(diǎn)雜合，另外3個(gè)QTL位點(diǎn)純合），從中選擇15個(gè)材料，自交獲得BC1F1:2家系，并考察株高。共獲得3120個(gè)BC1F1:2單株，從中劃分出2個(gè)極端表型組，低值組580個(gè)單株，高值組567個(gè)單株，并分別組成混池（低池與高池）；接著，對(duì)混池展開全基因組測(cè)序（＞280×），檢測(cè)到197021個(gè)高質(zhì)量SNPs。利用smoothLOD與ED4算法分析出Chr.7只有一個(gè)峰，并且峰的位置在135.3Mb。KASP標(biāo)記分型也證實(shí)峰的位置處于135.1與135.2之間。有趣的是，smoothLOD法將qPH7定位在chr：135216475bp，此位點(diǎn)正好處在Zm00001d020874上。Zm00001d020874編碼一個(gè)NF-YC結(jié)構(gòu)域蛋白，它的擬南芥同源蛋白與開花時(shí)間有關(guān)。

圖2.?qPH7精細(xì)定位與候選基因挖掘

慮到分離群體中重組blocks的存在，利用增加滑窗大小的方法識(shí)別目標(biāo)區(qū)域的重組blocks。由于smoothLOD與G’為連續(xù)變量，所以采用ED/SNP的方法分析重組blocks，結(jié)果顯示候選基因與peak間距離＜150kb。因此，候選基因的區(qū)間在300?kb，其中包含13個(gè)基因，也包括基因Zm00001d020874。

因?yàn)榻粨Q單株數(shù)量與定位區(qū)間大小密切相關(guān)，所以確保較大的混池規(guī)模至關(guān)重要。根據(jù)模擬數(shù)據(jù)，QTG-seq相對(duì)低的測(cè)序深度（＜100×）足夠檢測(cè)出所有的重組blocks，因?yàn)槊總€(gè)重組block包含許多SNPs，沒(méi)必要對(duì)每個(gè)重組block的所有reads測(cè)序。因此，為了平衡定位精度與測(cè)序成本，在使用QTG-seq方法時(shí)，建議增大混池規(guī)模與相對(duì)低的測(cè)序深度。

為進(jìn)一步確定候選基因，本研究又通過(guò)RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)，Zm00001d020874表達(dá)量在雙親的莖頂端分生組織（SAM）與幼嫩節(jié)間組織中存在顯著性差異。基于擬南芥同源蛋白功能與smoothLOD定位信號(hào)，認(rèn)為Zm00001d020874是qPH7的候選基因，并且后續(xù)的CRISPR基因敲除，蛋白互作驗(yàn)證等實(shí)驗(yàn)均暗示Zm00001d020874是控制株高的基因。

圖3.?候選基因的驗(yàn)證

Monte Carlo模擬支持QTG-Seq的可靠性

4個(gè)Monte Carlo模擬實(shí)驗(yàn)如下：

1.?PVE與QTG位置偏差大小：5%時(shí)，接近80kb；≥10%時(shí)，30-60kb

2.?取樣率與QTG位置偏差大?。寒?dāng)取樣率為20%時(shí)，位置偏差略大；較大的取樣比例會(huì)增加群體大小，但有效重組事件數(shù)量也會(huì)增加

3.?群體大小與QTG位置偏差大?。寒?dāng)群體大于4000時(shí)，位置偏差小于60kb

4.?測(cè)序深度與檢測(cè)力：當(dāng)測(cè)序深度大于100×?xí)r（混池超過(guò)1000個(gè)個(gè)體），檢測(cè)力達(dá)到100%

圖4.?SmoothLOD算法影響定位準(zhǔn)確性的各種因素

參考文獻(xiàn):

Zhang H., Wang X., Pan Q., Li P., Liu Y., Lu X., Zhong W., Li M., Han L., Li J., Wang P., Li D., Liu Y., Li Q., Yang F., Zhang Y.-M., Wang G., and Li L. QTG-Seq Accelerates QTL Fine Mapping through QTL Partitioning and Whole-Genome Sequencing of Bulked Segregant Samples.?Mol Plant.?2019 Mar 4;12(3):426-437.

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