1、固定

1.1植物組織

1)配置固定Buffer

2)實驗步驟

A.收集4g新鮮、干凈、長勢完全正常的幼嫩組織樣品（如有污物，需要提前處理干凈），并至于冰上

B.每2g收集的新鮮組織使用剪刀剪成碎片，各放置于一個50ml的離心管中

C.往50ml離心管中添加提前預冷的35ml固定Buffer和2ml 36%的甲醛溶液，室溫下，旋轉雜交爐或者其它可旋轉設備中旋轉反應90min

D.加入2.5ml 2M的甘氨酸，使用脫色搖床100r混勻5min，終止交聯(lián)

E.濾掉固定液，用無菌ddH2O清洗幾次（至無泡沫）

F.吸干樣品表面水分，將樣品至于液氮中研磨

G.每4g研磨后的樣品存于一個50ml離心管中，并將離心管至于自封袋中，在-80℃保存?zhèn)溆?/p>

1.2動物組織

1)取1g處理干凈的組織樣，將樣本置于液氮中充分研磨

2)將研磨后的組織置于預冷的50ml離心管中，加入30ml 1xPBS充分混勻

3)使用Falcon細胞網過篩2次（100um+40um），除去雜質，收集濾液，加入35ul PMSF和適量的1x PBS，補至35ml

4)加入2ml 37%甲醛，室溫條件下置于旋轉搖床上反應60min

5)加入2.5ml 2M的甘氨酸，使用脫色搖床100r混勻5min，終止交聯(lián)

6)3000g 4℃離心5min，棄掉上清保留沉淀

1.3速凍植物組織

1)取50mg速凍組織樣于2ml國產離心管中，加入鋼珠，使用打碎儀液氮充分研磨

2)在研磨后的組織中加入1ml的NIBuffer工作液1中，震蕩混勻之后過100um的濾網，補充適量的NIBuffer工作液1至全部過濾完成，使用50ml離心管收集濾液（冰上操作）

3)在濾液中加入巰基乙醇、PMSF和37%甲醛溶液，室溫雜交反應一定時間

4)加入2.5ml 2M的甘氨酸，使用脫色搖床100r混勻5min，終止交聯(lián)

5)3000g 4℃離心5min，棄掉上清保留沉淀

1.4細胞

1)用1ml 1x PBS重懸細胞樣品（要求客戶自己固定完成），轉移至1.5ml離心管中

2)4℃ 650g離心10min，棄上清

3)將1ml Lysis Buffe 工作液加入到裝有樣品沉淀的離心管中，充分混勻，重懸樣品

4)離心管放在冰上，并置于搖床上100r，混勻15min

5)650g，4℃，離心10min，棄掉上清，保留沉淀

1.5血液

1)取1ml新鮮全血至50ml離心管中，加入3ml紅細胞裂解液，輕輕混勻

2)冰上放置15min（每5min顛倒混勻一次）

3)4℃450g離心10min，棄掉上清

4)加入2ml的紅細胞裂解液，輕輕混勻白細胞

5)4℃450g離心10min，棄掉上清

6)加入45ml 1XPBS，重懸沉淀

7)加入2.5ml37%甲醛，充分混勻，室溫旋轉雜交60min

8)加入2.5ml 2M的甘氨酸，使用脫色搖床100r混勻5min，終止交聯(lián)

9)650g 4℃離心5min，棄掉上清保留沉淀

2、細胞裂解和酶切

1)配置適當裂解體系冰上裂解細胞

2)用梯度密度離心法從裂解的細胞中提取細胞核

3)用限制性內切酶酶切細胞核

3、末端標記和平端連接

1)配置適當標記體系對末端標記生物素

2)將補平的末端用T4 DNA連接酶進行平末端連接

4、DNA純化（解交聯(lián)）

1)配置解交聯(lián)反應試劑

2)將解交聯(lián)反應試劑加入樣品中，充分混勻，金屬浴55℃，900rpm反應30min

3)加入適量的NaCl溶液，充分混勻，金屬浴65℃，900rpm反應90min

4)反應結束后5000rpm室溫離心3min，取上清液至新的離心管中

5)加入XP磁珠，混勻瞬時離心，室溫孵育10min

6)將樣品放置于磁力架上，直到液體澄清

7)小心棄掉上清液，加入200ul新鮮配置的80%乙醇，靜置20s，棄掉上清液

8)重復步驟7

9)取下離心管，瞬時離心，吸干凈殘留的液體

10)室溫靜置3min，待磁珠表面呈現磨砂狀

11)將離心管從磁力架上取下來，加入85ul EB，充分混勻磁珠，室溫靜置5min

12)將離心管置于磁力架上，待到液體澄清，將上清液轉移至新的離心管中

5、Hi-C文庫制備（采用Mate-pair Kit）

5.1文庫制備流程

取1ug DNA樣品（體積最大取41ul）除去末端標記但未連接的DNA，金屬浴反應，反應結束后用于后續(xù)的實驗

1)Ampure XP磁珠純化DNA

A.取90ul的XP磁珠至上述反應結束的離心管中，用移液器吹吸混勻，瞬離后室溫靜置5min

B.將樣品置于磁力架上，待液體澄清后，小心棄掉上清液

C.加入200ul新鮮配置的80%乙醇，室溫靜置20s，小心移除上清液

D.重復步驟C

E.取下樣品管，瞬時離心，吸干殘留的液體

F.將離心管重新置于磁力架上，室溫靜置2-4min，磁珠表面無明顯水珠即可

G.從磁力架上取下離心管，加入18ul NF水，混勻重懸磁珠，室溫孵育5min

H.將樣品置于磁力架上，待液體澄清后，小心吸取上清液至新的離心管中備用

2)片段化、末端修復及加A

A.取0.5ug（最大體積17ul）純化后的DNA

B.加入配置好的反應試劑，混勻后瞬離

C.置于PCR儀中按照設置好的程序進行反應

3)接頭連接及純化

A.在反應結束后的樣品中加入接頭連接需要的試劑

B.吹吸混勻，瞬離后置于PCR儀上進行反應

C.在反應結束的樣品中加入50ul的XP磁珠，混勻瞬離，室溫反應5min

D.將樣品置于磁力架上，待液體澄清后，小心棄掉上清液

E.加入200ul新鮮配置的80%乙醇，室溫靜置20s，小心移除上清液

F.重復步驟E

G.取下樣品管，瞬時離心，吸干殘留的液體

H.將離心管重新置于磁力架上，室溫靜置2-4min，磁珠表面無明顯水珠即可

I.從磁力架上取下離心管，加入28ul NF水，混勻重懸磁珠，室溫孵育5min

J.直到液體澄清后小心轉移上清液至新的離心管中

4)目標捕獲

A.使用TWB和BB試劑重懸C1磁珠

B.取10ul重懸后的使用BB溶解的磁珠，加入純化后的樣品中

C.混勻后置于旋轉的混勻儀反應15min

5)PCR文庫擴增及片段篩選

A.將樣品置于磁力架上，待液體澄清之后棄掉上清液

B.分別使用200ul的BB試劑和NEB試劑重懸磁珠

C.棄掉上清，瞬離，離心管置于磁力架上，用槍頭吸干殘留的液體

D.室溫靜置2-4min，至磁珠表面無明顯水珠

E.取下離心管，加入10ul的NF水，重懸磁珠，用于PCR擴增

F.配置好PCR擴增試劑后，混勻，連同磁珠一起置于PCR儀上進行擴增

G.PCR結束后，將樣品置于磁力架上，待液體澄清后吸取上清液至新的離心管中

H.補水至50ul，并加入30ul的XP磁珠，吹吸混勻室溫靜置5min

I.置于磁力架上，待液體澄清后，棄掉上清

J.加入200ul新鮮配置的80%乙醇，室溫靜置20s，小心移除上清液

K.重復步驟J

L.取下樣品管，瞬時離心，吸干殘留的液體

M.將離心管重新置于磁力架上，室溫靜置2-4min，磁珠表面無明顯水珠即可

N.取下樣品管，加入30ul的Elution Buffer，混勻，瞬離，室溫靜置5min

O.置于磁力架上，待液體澄清后吸取上清液進行文庫質檢

5.2文庫質檢

1)質檢方法：文庫通過 Qsep-400 進行片段質檢， 使用酶標儀進行文庫濃度的定量

2)庫檢標準：庫檢片段呈正態(tài)分布狀，300bp起峰，800bp落峰；片段無前后拖尾、無接頭、無雜峰；濃度大于1ng/ul

5.3建庫用試劑耗材

1)文庫構建試劑盒：VAHTSTM Fg DNA Library Prep Kit? for I11umina 貨號ND617-02

2)產物純化磁珠：Agencourt? AMPure? XP，貨號A63882

3)質檢使用試劑：Qsep400 標準DNA 卡夾

4)定量使用試劑：Qubit TM dsDNA HS Assay Ki

5)1.5ml離心管、0.2ml PCR管、10ul，200ul槍頭：Axygen

5.4建庫用設備

6、測序方法

測序設備：NovaSeq X plus

測序試劑盒：NovaSeqTMX? Series25B Rgt Kit

期刊：Nature

導讀

在細胞周期的中間階段，染色質以分級結構排列在核中，這在調節(jié)基因表達方面具有重要作用。但是，人類胚胎發(fā)生過程中3D染色質結構的動力學仍然未知。在這里作者報告，與小鼠精子不同，人類精子細胞不表達染色質調節(jié)劑CTCF，其染色質不包含拓撲關聯(lián)域（TADs）。人類受精后，TAD結構在胚胎發(fā)育過程中逐漸建立。此外，A / B區(qū)室化在人類胚胎2細胞階段中消失，并在后續(xù)胚胎發(fā)育過程中重新建立。值得注意的是，阻斷合子基因組激活（ZGA）可以抑制人類胚胎中TAD的建立，而不能抑制小鼠或果蠅中的TAD。值得注意的是，CTCF在ZGA之前以非常低的水平表達，然后在觀察到TAD時在ZGA階段高表達。CTCF基因被敲除后，胚胎中TAD結構顯著減少，這表明合子基因組激活（ZGA）階段，人類胚胎中的TAD建立需要CTCF表達。結果表明，CTCF在人類胚胎發(fā)生過程中的3D染色質結構建立中具有關鍵作用。

實驗方法

材料：小鼠精子和桑椹胚

方法：Hi-C, 免疫染色，DNA甲基化測序，ATAC-seq, RNA-seq，Smart-seq2

研究內容

1、人類早期胚胎的TAD結構

作者檢測了人類精子和胚胎中的染色質相互作用。但是沒有檢測到人類2細胞胚胎中TAD結構的特征性“三角”相互作用。在8細胞胚胎中這些相互作用的水平很低，并且在人類胚胎發(fā)育過程中相互水平逐漸升高（圖1a）。為了排除read深度對分析的影響，在繪制每個階段的相互作用熱圖時，作者隨機選擇了相同數量的read。 作者進一步調查了人類胚胎發(fā)育過程中的TAD重編程。使用TAD分離分數方法（Methods）來獲得TAD結構和TAD邊界。即使read深度很低，也可以檢測到大多數TAD域。作者還計算了TAD信號和方向指數。本文的數據表明，TAD信號方差和方向指數在2細胞階段最低，并隨著發(fā)育而逐漸增加（圖1b）。為了排除人胚TAD分析中可能的實驗偏差，本文使用了小鼠morula胚胎作為對照，將其與人2細胞，8細胞和morula胚胎混合。然后，為這些混合樣品構建了Hi-C庫。同時，還為未與人類樣品混合的小鼠桑morula胚胎生成了Hi-C庫。這些結果表明，混合樣品中的TAD結構在人類2細胞胚胎中仍然模糊不清，在8細胞胚胎和桑胚胎中變得更清晰，而所有摻入的小鼠morula胚胎均清晰可見TAD結構。來自混合樣品的TAD信號分析支持了作者的發(fā)現，即TAD結構在人類胚胎發(fā)生過程中得以確立。
總之，這些數據表明，TAD結構在人的2細胞胚胎中基本上不存在，在8細胞胚胎中很少存在，并且在胚胎發(fā)育過程中變得越來越明顯。

圖a 人類精子，人類胚胎和H1人類ES細胞（hESCs）中高階染色質結構相互作用熱圖，分辨率為40 kb（合并的生物學重復；n = 2-3）。

圖b 用相等數量的reads（每個階段從2-3個生物學復制中產生）計算出的人類胚胎中TAD信號的相對方差。每個點代表一個染色體。顯示P值；雙面Wilcoxon秩和檢驗。數據為平均值±s.e.m。

圖c 人類胚胎中500kb分辨率的5號染色體的PC1值軌跡和Pearson相關熱圖，具有相同的read次數（每個階段2-3次生物復制）。

圖d 具有相同reads的人胚胎中的compartment強度。數據為平均值±標準偏差，通過自舉獲得（n = 100）。通過單側t檢驗計算P值。

圖1. 人類精子和胚胎的三維染色質結構

2、人類精子不包含傳統(tǒng)的TAD結構

先前的研究表明，TAD結構存在于成熟的小鼠精子中。令人驚訝的是，本文沒有在人類精子中觀察到典型的三角TAD結構（圖1a）。例如，人類精子的HOXA簇區(qū)域沒有TAD邊界，但存在于人類胚泡（圖2a）和小鼠精子中。為了驗證該觀察結果，繪制了人類精子和胚泡在不同讀取深度下的TAD信號方差。與小鼠精子和人類胚泡不同，人類精子系的y截距接近0（圖2b），表明人類精子中不存在TAD。本文進一步比較了人類精子和小鼠精子之間相互作用插入物大小的密度，結果表明，人類精子在4 Mb（中程）附近出現一個主峰，而小鼠精子在933 kb附近出現肩峰，在41 Mb左右出現遠距離主峰。此外，人的精子和小鼠的精子之間的接觸概率衰減曲線也有差異?？傊@些結果表明人類精子不含TAD。

為了排除潛在的實驗偏見，本文將小鼠精子與人類精子混合，并為精子混合物構建了一個Hi-C庫（方法）。平行地，本文混合了人類HeLa細胞和小鼠HT22細胞。與本文之前的結果一致，本研究在精子混合物中觀察到了來自小鼠精子而非人精子的TAD。相比之下，在人類HeLa細胞和小鼠HT22細胞中均觀察到TAD結構。這些數據證實了人類精子中沒有TAD。
CTCF-cohesin復合物在高級染色質結構中具有重要作用。本研究調查了人類和小鼠精子中CTCF和粘著蛋白的水平。RAD21是黏附蛋白復合物的一個亞基，存在于人類和小鼠的精子中）;但是，在人類精子中未檢測到CTCF，并且在使用短干擾RNA（siRNA）耗盡CTCF的細胞系中表達很弱，但是在小鼠精子，人類和對照小鼠細胞系中檢測到了CTCF（圖2c）。由于CTCF的消耗會導致TAD結構的破壞，因此CTCF的缺乏可能是人類精子中TAD結構喪失的基礎。

圖a 人類精子和胚泡中HOXA簇周圍的相互作用熱圖，分辨率為10 kb（生物學重復; n = 3）。

圖b 人精子和胚泡中TAD信號方差與read深度（1 /讀取次數）的線性回歸曲線。在y軸上標記了人類胚泡和精子的回歸線的線性外推。在每個讀取深度進行降采樣分析3次（n = 3）。

圖c 用Ponceau染色的小鼠精子，人精子和體細胞系中CTCF的Western印跡。黑色箭頭表示CTCF波段。每個樣品在兩個生物學獨立的重復樣本上重復實驗。

圖2. 人類精子不包含傳統(tǒng)的TAD結構

3、TAD邊界的建立

TAD結構在人類2細胞胚胎中并不明顯。但是，兩細胞胚胎中的某些區(qū)域顯示出絕緣子結合的跡象，可以分隔上游和下游相互作用。在胚胎后期，這些區(qū)域大部分成為TAD邊界（圖3a）; 這些區(qū)域因此可以被視為未成熟的TAD邊界。在這項研究中，本研究將未成熟的TAD邊界和成熟的TAD邊界都定義為絕緣邊界。然后，本研究分析了人類胚胎發(fā)育過程中絕緣邊界的動力學。本研究的數據表明，分別在2細胞，8細胞，morula 和胚泡階段分別形成635、905、317和306個絕緣邊界（圖3a）。本研究還在小鼠2細胞胚胎中發(fā)現了未成熟的TAD邊界，并確定了小鼠階段獲得的絕緣邊界。比較了人類樣品中2細胞階段的絕緣邊界與胚泡階段的總邊界，結果表明2細胞邊界與胚泡邊界的30％重疊（圖3b）。本研究的數據還顯示ZGA階段包含胚泡中67％的邊界，這與小鼠模型中的比例相似（圖3b）。此外，當將ZGA階段的人類邊界與小鼠的邊界進行比較時，發(fā)現存在明顯的重疊（圖3c）。例如，本研究在人和小鼠的ZGA階段發(fā)現了TTC1和CCNG1基因周圍的絕緣邊界。

接下來，作者試圖確定在早期階段優(yōu)先形成絕緣邊界的基因組區(qū)域。在2細胞階段首先獲得邊界的基因組區(qū)域與持家基因的距離小于在后期階段獲得邊界的邊界區(qū)域的距離（圖3d）。在小鼠胚胎中觀察到了類似的結果。這些數據表明，在較早階段獲得的絕緣邊界往往位于人和小鼠的看家基因周圍。作者還發(fā)現邊界附近的管家基因的表達水平傾向于高于其他管家基因的表達水平。
據報道，重復元素與細胞系中的TAD邊界相關。因此，作者分析了胚胎中特定于階段獲得的邊界周圍重復元件的富集。作者的數據表明，在人類早期階段，Alu重復序列（而不是LINE或MIR重復序列）（圖3e）富集在絕緣邊界周圍。在小鼠胚胎中觀察到了相似的結果。例如，在人類或小鼠RAB5A基因周圍的2細胞階段獲得的絕緣邊界被建立在Alu密集區(qū)。此外，作者的數據表明AluS元素在2細胞階段獲得的絕緣邊界周圍高度富集（圖3e）。此外，與其他階段相比，在2細胞階段獲得的絕緣邊界周圍的AluS重復序列在裂解階段得到了高度表達?？傮w而言，這些結果表明，人類胚胎中絕緣的邊界傾向定位在Alu密集區(qū)周圍。

圖a 絕緣得分的熱圖，以在特定階段（±1 Mb范圍）獲得的絕緣邊界為中心。n，特定階段獲得的絕緣邊界的數量；b，絕緣邊界中心。

圖b 相對于胚泡邊界數，每個階段中絕緣邊界數的累積百分比。

圖c 維恩圖，顯示人ZGA邊界和小鼠ZGA邊界之間的重疊（χ2檢驗）。

圖d 累積分布函數圖，用于特定階段獲得的邊界與人類胚胎中最接近的管家基因的距離（來自2-3個生物學重復的合并數據）。虛線表示200 kb的距離。P = 3.24×10?8（2單元vs 8單元階段）; P = 9.95×10-8（2細胞期與桑ula鼠比較）; P = 3.83×10-11（2細胞期vs胚泡）;雙面Kolmogorov-Smirnov檢驗。

圖e 在人類胚胎的特定階段獲得的絕緣邊界處AluS元素的富集。

圖3. 在人類胚胎發(fā)育過程中建立絕緣邊界

4、TAD的建立依賴于ZGA以及CTCF調控染色體

先前的報道表明，TAD的建立獨立于小鼠和果蠅胚胎中的ZGA。作者調查了這些特征在人類中是否保守。作者用α-amanitin處理人合子以抑制ZGA，并在8細胞階段收集了胚胎。令人驚訝的是，在經過α-amanitin處理的8細胞胚胎中，TAD的結構模糊不清（圖4a）。用α-amanitin處理的胚胎中TAD信號的相對方差也顯著低于未處理的8細胞胚胎（圖4b）。因此，在人類胚胎中建立TAD需要ZGA。
接下來，作者旨在鑒定ZGA期間參與TAD建立的蛋白質。粘著蛋白復合物和CTCF在高階染色體結構中具有重要作用。因此，作者研究了這些蛋白質表達的差異。粘附蛋白復合物的亞基，例如RAD21，已經在ZGA之前在人類胚胎中高度表達。相比之下，當在人類胚胎中首次觀察到TAD結構時，CTCF的表達在ZGA階段之前非常有限，并且在8細胞階段急劇增加（圖4c）。在經α-amanitin處理的8細胞胚胎中，CTCF表達受到抑制。一致地，免疫染色圖像顯示在2細胞核中幾乎未觀察到CTCF蛋白（圖4d）。CTCF明顯存在于未經處理的8細胞核中，但在經α-amanitin處理的8細胞核中卻不存在（圖4d）。這些結果表明CTCF表達需要人ZGA。
接下來，作者研究了在人類胚胎中建立TAD對CTCF的需求。作者通過將CTCF siRNA（siCTCF）注入人受精卵來抑制CTCF的表達，并在morula期收集胚胎（圖4d）。值得注意的是，在siCTCF morula中幾乎沒有觀察到三角形TAD結構（圖4e）。相對的TAD信號方差支持抑制siCTCF morula中TAD的建立。一致地，大多數TAD邊界在對照morula中消失，而在siCTCF morula中變弱。因此，本研究的數據表明ZGA期間CTCF表達是人類胚胎中TAD建立所必需的。

圖a 人8細胞和經α-amanitin處理的8細胞胚胎中的相互作用熱圖。

圖b 人2細胞（n = 3），8細胞（n = 3）和經α-amanitin處理的8細胞胚胎（n = 3）中TAD信號相對方差的箱形圖。方框顯示第25、50和75個百分位，胡須顯示1.5倍的四分位間距。***對于8細胞和α-amanitin處理過的8細胞之間的所有成對比較，校正后的P <0.001（帶有Benjamini-Hochberg多重檢驗校正的雙面Wilcoxon秩和檢驗）。

圖c 人類胚胎發(fā)育過程中CTCF表達的動態(tài)（來自參考文獻22的表達數據；每個階段3至20個細胞）。數據為平均值±s.e.m。RPKM，每百萬個映射讀操作的每千個轉錄本的讀操作數。

圖d CTCF在人類胚胎中的免疫熒光（n = 2-3）。比例尺40μm。

圖e 跟蹤未處理的對照morula和siCTCF morula中的TAD結構，其中覆蓋了基因表達。

圖4. CTCF調控人類胚胎中染色質的建立

總結

盡管人類和小鼠胚胎都顯示出高階染色質結構的全基因組重編程，但人類和小鼠胚胎之間的染色質結構存在很大差異。本研究的數據為哺乳動物胚胎發(fā)育過程中染色質結構的建立提供了寶貴的資源和機制的見解。

文獻下載：

https://international.biocloud.net/zh/article/detail/31801998
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目前Hi-C?技術主要的應用方向是輔助基因組組裝和染色質互作。輔助基因組組裝：在已有二代或三代組裝的Draft genome序列和已知染色體數目的前提下，利用Hi-C測序數據將Draft genome序列進行染色體群組的劃分，并確定各序列在染色體上的順序和方向，使基因組組裝組裝水平提升到染色體水平。染色質互作：利用Hi-C技術揭示基因組的一般結構特征，包括從隔室（A/B Compartments）到拓撲相關結構域（TAD）,最后再到環(huán)（loop）的染色質層級結構；還可以與ATAC-seq、ChIP-seq、DNase-seq和RNA-seq等數據進行多組學分析揭示基因組三維結構與表觀遺傳修飾、基因密度和轉錄活性之間的關系。

說到Hi-C輔助基因組組裝，百邁客還真是碩果累累呢！2018年就有三篇Nature Genetics和一篇Giga Science見刊，2019年才過去短短兩個多月，就已經有2篇Molecular Plant見刊了，這成果真是可喜可賀?。?/p>

下面就聽小編娓娓道來吧~~

研究背景

棉花是世界上最重要的商業(yè)作物之一，同時也是研究植物多倍化的有價值的資源。亞洲棉最可能在馬達加斯加或印度河流域文明（巴基斯坦摩亨佐達羅）開始馴化，隨后分散到非洲和亞洲一些地區(qū)。亞洲棉最初在1000多年前作為觀賞植物引入中國。當在地方的農業(yè)生態(tài)環(huán)境適應和人類選擇影響的過程中，中國的Gossypium arboreum形成了獨特的地理種群，稱之為“sinense cotton”。雖然棉花種植者已經基于RFLP和SSR markers構建了各種遺傳圖譜，但是G. arboreum和G. herbaceum優(yōu)良農藝和經濟性狀的基因尚未被鑒定。本研究中，利用了三代PacBio和Hi-C技術，重新組裝了高質量的亞洲棉基因組，分析了243份二倍體棉花種質的群體結構和基因組分化趨勢，同時確定了一些有助于棉花皮棉產量遺傳改良的候選基因位點。

材料選擇

基因組測序材料：二倍體G. arboreum栽培品種cultivar Shixiya1（SXY1）；

自然群體材料選擇：243份棉花，包含230份亞洲棉G. arboretum和13份草棉G. herbaceum?[243份棉花選自國家種質基因庫（中國安陽），種植在中國農業(yè)科學院棉花研究所（ICR，CAAS）的溫室中]，插入片段長度500 bp；測序深度6X；

遺傳群體材料選擇：親本（GA0146和GA0149），測序深度20X；2個混池（F2群體，有絨型和無絨型各20個子代），測序深度30X；

測序策略：PacBio RSII和Illumina HiSeq 2500分析軟件：基因組組裝（Canu和Falcon；Quiver；Pbjelly）；TEs轉座元件注釋（RepeatScout，LTR-FINDER，MITE和PILER；Repbase；REPET；RepeatMasker）；基因預測注釋（geMoMa；Augustus；PASA；EVidenceModeler；InterProScan）群體研究：比對注釋（BWA，Picard，GATK，ANNOVAR）；群體結構分析（FastTree，PHYLIP，STRUCTURE）；連鎖不平衡分析（Haploview）；遺傳多樣性分析（π，Fst）；全基因組關聯(lián)分析（EMMAX）；

主要研究結果

1、亞洲棉基因組組裝更新

利用三代測序儀PacBio平臺共獲得142.54Gb的原始數據，組裝1.71Gb亞洲棉基因組，Contig N50=1.1 Mb，最長的Contig為12.37 Mb。利用Hi-C技術獲得超過20×的reads，將組裝的1573Mb的數據定位到13條染色體上，與已經發(fā)表的基因組相比，當Hi-C數據比對到更新的基因組后，對角線外的不一致性明顯減少（見圖1a和b）。

圖1，Hi-C數據在兩版亞洲棉基因組上的比對

注：a. Hi-C數據與亞洲棉原基因組比對；b. Hi-C數據與亞洲棉更新基因組比對

2、二倍體棉花群體遺傳進化分析

共計選擇了243份二倍體棉花材料：230份亞洲棉G. arboreum?(A2)?和13份草棉G. herbaceum?(A1)，來自于中國南部(SC)，長江(YZR)和黃河（YER）。以雷蒙德氏棉（G. raimondii）為外群，構建系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，G. herbaceum（草棉）和G. arboretum（亞洲棉）聚類成2個獨立的群（見圖2a和b）。G. arboretum（亞洲棉）進一步又分為SC，YZR和YER三個群，顯示了地理分布模式的差異，進而利用PCA分析支持這一結果（見圖2c）。

圖2 二倍體棉花的群體分層分析

注：a，243份二倍體棉花系統(tǒng)發(fā)育樹；b，243份二倍體棉花的群體結構分析c，PCA主成分分析（中國亞洲棉的PCA分析；亞洲棉和草棉的PCA分析）

3、選擇性清除分析與GWAS分析

人工選擇在農作物的馴化和遷徙的過程中具有重要的作用。群體結構分析顯示當K=4時，YER與SC和YZR明顯不同（圖2b，K=4）。通過兩兩群體間的選擇性清除分析（FST）鑒定出了分別覆蓋到59，53和51個顯著遺傳分化的區(qū)域。SC和YZR之間的21個分化的區(qū)域（約43.5 Mb?含有915個基因）在群體SC和YER之間是保守的（圖3a）。對來自不同環(huán)境下的11個重要性狀進行全基因組關聯(lián)分析，在98個顯著關聯(lián)的信號中，其中25信號個來自基因區(qū)（外顯子或內含子區(qū)），包含與形態(tài)性狀相關的8個信號區(qū)，與產量性狀相關的6個信號區(qū)，與油籽性狀相關的3個信號區(qū)；剩余73個信號來自非編碼區(qū)。大部分農藝性狀的GWAS關聯(lián)信號中顯示地理差異，如分支數，開花期，鈴重和抗病性這些性狀定位在保守的基因區(qū)（圖4b）。

參考文獻：Du X, Huang G, He S, et al. Resequencing of 243 diploid cotton accessions based on an updated A genome identifies the genetic basis of key agronomic traits[J]. Nature genetics, 2018, 50(6): 796.

 

百邁客成功案例二：異源四倍體陸地棉和海島棉Hi-C輔助基因組組裝

英文題目：Reference genome sequences of two cultivated allotetraploid cottons?Gossypium hirsutum?and?Gossypium barbadense.

中文題目：兩個異源四倍體陸地棉和海島棉基因組破譯

發(fā)表期刊：Nature Genetics

發(fā)表時間：2018年12月

合作單位：華中農業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室

研究方法：基因組、比較基因組分析、遺傳圖譜構建及QTL定位等

研究背景

棉花是世界上最大的天然紡織纖維來源，每年纖維產量的90％以上來自異源四倍體棉花（G. hirsutum和G. barbadense），它起源于大約1-2百萬年前的異源多樣化事件，隨后是數千年的不對稱亞基因組選擇。陸地棉（G. hirsutum）由于其高產而在全世界種植。G. barbadense以其卓越的纖維質量而受贊譽。為了培育產生纖維更長，更細和更強韌的陸地棉（G. hirsutum）品種，一種合理有效的方法是將海島棉（G. barbadense）的優(yōu)良纖維性狀引入陸地棉?；蚪M學啟動的育種策略需要對基因組組織進行詳細而有力的理解。

材料選擇

高度純合陸地棉（TM-1)和海島棉（3-79），用于基因組測序；由陸地棉Emian22作為受體親本，海島棉3-79作為供體親本構建包含168個個體的CSSLs群體，做重測序，平均深度?> 6×；13份二倍體D型基因組的棉花做重測序，平均深度?> 15×；Xuzhou 142與其自然突變體Xuzhou 142f1雜交，構建F2群體，做混池測序。

測序策略：PacBio RS II、BioNano和Illumina HiSeq

分析軟件：

基因組組裝：Canu (version 1.3)?，BLASR (version 1.3.1)?，BWA (version 0.7.10-r789)?，Pilon(version 1.22)?；光學圖譜糾錯：核酸內切酶Nt.BssSI23，AutoDetect，IrysSolve；Hi-C染色體掛載：核酸內切酶HindIII，BWA（version 0.7.10-r789），LACHESIS，HiC-Pro；基因組完整性評估：BUSCO評估；TE注釋：PASTEClassifier (version 1.0)；RepeatMasker (version 4.0.6)；基因預測和注釋：Genscan，Augustus (version 2.4)，GlimmerHMM (version 3.0.4)，GeneID (version 1.4)和SNAP (version 2006-07-28)；GeMoMa (version 1.3.1)；假基因組預測：GenBlastA (version 1.0.4)，GeneWise (version 2.4.1)；

著絲粒區(qū)域鑒定：blastn，SPSS software (version 17.0)?；基因組共線性分析：MUMmer (version 3.23)，GATK(version 3.1.1)，Samtools(version 0.1.19)?，MCScanX package；結構變異檢測：MUMmer3 (version 3.23)；二倍體棉重測序SNPs鑒定：Trimmomatic (version 0.32)，BWA；包含168個個體的CSSLs群體SNPs鑒定：BWA，GATK和Samtools；CSSLs群體QTLs定位與表達分析：QTL IciMapping (version 4.0)?；TopHat2 (version 2.0.13)?；Cufflinks (version 2.2.1)；STRUCTURE (version 2.3)?；TASSEL software (version 5.0)?；

主要研究結果

1、陸地棉Gossypium hirsutum和海島棉Gossypium barbadense基因組組裝及注釋

???本研究利用PacBio RSII、BioNano和Hi-C技術組裝出了高質量的異源四倍體陸地棉G. hirsutum?acc. TM-1和海島棉G. barbadense?acc. 3-79基因組，最終組裝出26條染色體。在陸地棉和海島棉中分別預測到70,199和71,297個基因，PacBio數據分析顯示，在全基因組范圍內陸地棉6mA甲基化占所有腺嘌呤的0.21%，海島棉占0.22%。且6mA甲基化修飾在每條染色體上是均勻分布的，而5mC修飾在染色體臂中分布較少（見圖1）。

圖1 陸地棉和海島棉染色體特征（含表觀遺傳標記）

?2、陸地棉和海島棉染色體結構變異分析

高質量的參考基因組使研究人員直接通過比較基因組就能鑒定大的結構變異成為可能。發(fā)現有170.2 Mb的基因組序列被鑒定為G. hirsutum和G. barbadense之間的倒位，包括120.4 Mb的At亞基因組和49.8 Mb的Dt在A06染色體中發(fā)現了4個大的倒位變異，包括3個染色體臂內倒位（in1, in3 and in4）和1個染色體臂間倒位（in2），通過Hi-C數據在斷點周圍離散的染色質相互作用（圖2a），突出了Hi-C技術識別大規(guī)模染色體重排的優(yōu)勢。光學圖（BioNano optical maps）譜數據進一步支持了這些反轉斷裂位點（圖2b）。

 

圖2，陸地棉和海島棉A06染色體倒位鑒定

注：a，Hi-C互作熱圖；b，光學圖譜鑒定

3、漸滲系的構建及QTLs定位

由陸地棉Emian22作為受體親本，海島棉3-79作為供體親本構建包含168個個體的CSSLs群體，旨在引入有利的變異，如纖維質量。QTL定位分析，共鑒定到5個性狀的13個QTLs位點，其中控制纖維長度位點2個，控制纖維強度位點4個，馬克隆值位點2個，纖維伸長率位點2個，纖維均勻度位點3個（圖3）。在這些QTLs位點中，9個位點之前未被鑒定出，通過檢驗13個QTLs中的基因表達水平，研究人員檢測到了235個在纖維發(fā)育過程中高度表達的基因，同時還整合了基因組變異數據來預測候選基因，而這些基因值得進一步進行精細定位以確認對這些性狀具有重要影響的基因。

圖4，QTL定位結果展示

注：a，陸地棉纖維質量相關QTLs分布（紅框）；b，纖維長度相關QTL定位；c，纖維伸長率相關QTL定位

參考文獻：Wang M, Tu L, Yuan D, et al. Reference genome sequences of two cultivated allotetraploid cottons, Gossypium hirsutum and Gossypium barbadense[J]. Nature genetics, 2019, 51(2): 224.

 

英文題目：Allele-defined genome of the autopolyploid?sugarcane Saccharum spontaneum L.

中文題目：同源多倍體（Saccharum spontaneum L.）基因組等位基因鑒定

發(fā)表期刊：Nature Genetics

發(fā)表時間：2018年10月

合作單位：福建農林大學基因組與生物技術研究中心

研究方法：基因組、比較基因組、群體遺傳進化等

研究背景

栽培甘蔗（Saccharum?spp., Poaceae）相比其它主要作物與眾不同，因為它是多倍體種間雜種，具有極其復雜的基因組。目前甘蔗是世界上收獲量最大的第一作物和第五價值作物（FAO, 2012），甘蔗種植在90多個國家的約2600萬公頃土地上，每年收獲18.3億公噸，總產值接近570億美元，提供80％的糖和40％的乙醇，作為主要的糖和生物燃料原料作物。雖然現代甘蔗栽培種的高含糖量來源于栽培種“S. officinarum”，但是它們的耐寒性，抗病性和再生能力更多的來自于與含糖量低的親本“S. spontaneum”的回交中。Saccharum officinarum品種（2n= 8x=80），在莖中積累蔗糖達到干重的50％，但是易受生物和非生物脅迫的影響。自然狀態(tài)記錄下染色體數目最少的S. spontaneum種質（2n = 5x =?40）已經不存在了，然而，由另一種八倍體SES208單倍化形成的S.spontaneum“AP85-441”（1n = 4x = 32）為甘蔗染色體的原型的組裝提供了基礎。本研究闡釋了最重要，復雜基因組的基因組作物S. spontaneum遺傳藍圖和進化歷史。

材料選擇

S. spontaneum?AP85-441用于基因組測序；64份世界種質資源庫材料進行重測序；

測序策略：IlluminaHiSeq 2500和PacbioRSII

分析軟件：

基因組組裝：BAC文庫測序數據初步組裝（組裝軟件：ALLPATH-LG,SPAdes和SOAPdenovo2，保留組裝結果）；PacBio測序數據糾錯組裝（CANUv1.5）；Hi-C染色體分群（ALLHIC）。

基因注釋：重復序列預測（RepeatModeler），TE轉座子序列鑒定（RepeatMaskerversion 4.05；TEclassversion 2.1.3），串聯(lián)重復序列分析（TRFpackageversion 4.07）；基因注釋（MAKER，JBrowse，Trinity，PASA，SNAP，GENEMARK，AUGUSTUS等）；注釋完整性評估（BUSCOversion 3）；

等位基因變異及優(yōu)勢表達分析：單倍體基因組構建（nucmer，MUMmerpackage，Assemblytics）；等位基因鑒定（MCScanX，GMAP）；等位基因變異分析（nucmer，Assemblytics）；等位基因的優(yōu)勢表達（Trimmomatic，HiSAT2)。

重測序群體結構分析：序列比對與變異檢測（Bowtie2，SAMtools，BWA，GATK，SnpEffv3.6c)；基因組遺傳多樣性評估（π，Tajima’sD）；PCA分析（VCFtools，PLINK）；系統(tǒng)發(fā)育分析（ML trees，PHYLIP package）；群體結構分析（Admixture，STRUCTURE）；基因組重排區(qū)遺傳多樣性與不同多倍體種質的基因組遺傳多樣性分析（π，SNP density，Tajima’sD）。

主要研究結果

1、基因組測序組裝

本研究中利用Illumina、PacBio和Hi-C技術，加之本研究團隊研發(fā)的算法ALLHIC成功的將甘蔗基因組組裝到染色體水平，最終組裝出32條染色體，錨定了2.9 Gb基因組，涵蓋了97%的基因含量。進一步利用998,370 SNPs的高密度遺傳圖譜來驗證Hi-C組裝的結果，在兩種方法中，89%的contigs的順序是一致的。32條染色體中包含了8個同源組群和4組單倍型A，B，C和D（見圖1）。

圖1?S. spontaneum?AP85-441染色體與高粱染色體的比對

2、基礎染色體數目的減少

AP85-441基因組的組裝顯示了S. spontaneum的染色體數目從10降到8，而這與頻繁復制的古復制染色體對相關，通過與高粱的聚類比對，發(fā)現高粱祖先5號染色體和8號染色體同源物經歷了染色體裂變（見圖2）。SbChr05（A12）的祖先染色體斷裂分為兩個主要部分，即C5S（A12S）和C5L（A12L），分別轉移到SbChr06（A2）和SbChr07（A5）的祖先染色體；SbChr8（A11）的祖先染色體斷裂為兩個主要的部分，即C8S（A11S）和C8L（A11L），分別轉移到SbChr09（A6）和SbChr02（A7 + A9）的祖先染色體中。SbChr8和SsChr5之間及SbChr5和SsChr7之間近乎同源的短片段是在高粱與甘蔗分化前，高粱SSA形成于13.4 MYA同源基因的殘留物，同時發(fā)現，S5中較小的SSA區(qū)域和S8中SSA的較大區(qū)域在重排的AP85-441基因組中也是保守的。

圖2 禾本科染色體數進化（高粱n = 10到甘蔗n = 8）

 

3、S. spontaneum的起源與遺傳多樣性分析

研究中對世界種質資源庫的64份S. spontaneum材料進行重測序，發(fā)現其核苷酸多態(tài)性（π）[0.00021±0.000002 ]遠遠低于其它克隆繁殖的作物，如馬鈴薯，木薯，葡萄和柑。通過PCA主成分分析及群體結構分析發(fā)現64份材料分為3個群，這些群體也受到自然和地理起源推斷的64份種質的系統(tǒng)發(fā)育關系的支持（見圖3），group1來源于菲律賓，印度尼西亞和巴布亞新幾內亞；group2和group3來源于印度，巴基斯坦和伊朗。基因組倍性在三組中差異很大（從6x-16x）。通過系統(tǒng)進化分析發(fā)現，表明不同的倍性可能是從祖先獨立進化而來的。

圖3 64份甘蔗的群體結構與進化關系分析

參考文獻：Zhang J, Zhang X, Tang H, et al. Allele-defined genome of the autopolyploid sugarcane Saccharum spontaneum L[J]. Nature genetics, 2018, 50(11): 1565.

 

百邁客成功案例四：異源四倍體野生花生Hi-C輔助基因組組裝

英文題目：Genome of an allotetraploid wild peanut?Arachis monticola: a de novo assemble.

中文題目：異源四倍體野生花生（Arachis monticola）基因組組裝

發(fā)表期刊：Giga Science

發(fā)表時間：2018年6月

合作單位：河南農業(yè)大學

研究方法：基因組

研究背景

花生作為我國重要的經濟作物，廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)，是提供重要的蛋白和油料的基礎。作為豆科的重要分支之一，花生屬一共包括30個二倍體品種，1個異源四倍體野生花生(A.monticola)和1個異源四倍體栽培花生(A.hypogaea)(2n = 4x = 40)。作為栽培花生農藝性狀改良的重要野生資源供體，野生四倍體花生的基因組也一直是國內外學者的研究熱點。成功破譯四倍體野生花生的基因組有助于科學家和育種專家對A.hypogaea起源及馴化過程的理解。

材料選擇

野生四倍體花生A.monticola；

測序策略：Illumina X-ten、PacbioRSII和Bionano

分析軟件：

基因組組裝：Canu v1.5，WTDBG，Pilon（v1.22），LoRDEC v0.5，Falcon v0.7，quickmerge v0.2，Allpath-LG v1.4，IrysView v2.5.1等；Hi-C染色體掛載：HiC-Pro，LACHESIS，Pbjerlly2，GapCloser，Pilon；基因組質量評估：BUSCO pipeline v3.0.2?等。

主要研究結果

在這項研究中，研究人員以野生四倍體花生A.monticola為研究材料，進行測序得到36X SMRT subreads + 76X HiC data + 210X Bionano Irys data + 50XIllumina reads的測序數據，整合多種組裝工具的優(yōu)勢，最終獲得了參考基因組水平的高質量組裝結果。又利用BioNano和Hi-C等方法對基因組進行區(qū)分最終A.monticola得到的subgenome與祖先A基因組A.duranensis、祖先B基因組A.ipaensis之間的比較。并利用Hi-C數據對獲得的基因組進行準確性評估（見圖1）。

圖1 四倍體野生花生及兩個二倍體祖先熱圖評估

參考文獻：Yin D, Ji C, Ma X, et al. Genome of an allotetraploid wild peanut Arachis monticola: a de novo assembly[J]. GigaScience, 2018, 7(6): giy066.

 

百邁客成功案例五：雜草稻Hi-C輔助基因組組裝

英文題目：Population Genomic Analysis and De novo Assembly Reveal the Origin of Weedy Rice as an Evolutionary Game.

中文題目：群體基因組分析結合從頭組裝揭示雜草稻作為進化演繹的起源

發(fā)表期刊：Molecular Plant

發(fā)表時間：2019年1月

合作單位：沈陽農業(yè)大學

研究方法：基因組、比較基因組、群體遺傳進化

研究背景

作物雜草化一直以來都是作物學領域的一大難題，尤其是雜草稻（Oryza sativa f. spontanea）的起源與演化，至今尚未破解。雜草稻具有很強的生態(tài)適應性，但其種群獨特的遺傳特征是如何被逐漸塑造的還不是十分清楚。在氣候快速變化和人口增長的的世界，從雜草植物中分離基因對提高產量和糧食安全至關重要。然而，由于缺乏雜草種的參考基因組，已經極大地限制了優(yōu)良基因的發(fā)現和基因組結構水平上水稻雜草性的遺傳基礎。由于亞洲高緯度雜草稻（WRAH）分布到水稻種植的北部邊界（N50°14′），并且經歷了比栽培稻更強的選擇壓力，因此它強大的生態(tài)適應性可以為栽培的遺傳優(yōu)良的水稻提供有利的基因資源。

材料選擇

研究中一共使用303個水稻樣本用于測序，包括從中國東北和日本北部的亞洲高緯度（WRAH）采樣的248種雜草稻中篩選出的48份核心資源；43份現在或已大面積種植的共存栽培稻商業(yè)品種（Japonica-C）；26份從粳稻核心種質資源中篩選的溫帶粳稻地方品種（Japonica-L），在本研究中Japonica-M代表Japonica-C和Japonica-L的混合組。此外，本研究中還使用了145份秈型水稻樣本，包括136份地方品種和9份優(yōu)良品種以及其他3個典型的栽培稻亞群樣本（12份tropical?japonica、11份aus和3份aromatic）作者還收集了15份來自中國南方的中緯度雜草稻（WRSC）。

測序策略：Illumina Hiseq和PacBio

分析軟件：

303份水稻樣本的SLAF-seq結果SNP鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構建：SOAP，MEGA 7.0；遺傳多樣性分析：BioPerl；QTL定位：利用親本WR04-6和Qishanzhan構建F8RIL群體，包含168個子代，通過SLAF-seq技術HighMap軟件構建遺傳圖譜和QTL定位；群體進化推演分析：DIYABC v. 2.0.3

基因組組裝：Canu，WTDBG，Pilon（v1.22），bwa；Hi-C染色體掛載：bwa，LACHESIS，Pbjerlly2；重復注釋：LTR-FINDER v1.05，MITE-Hunter，Repeat Scout v1.0.5，PILER-DF v2.4，PASTEClassifier，RepeatMasker v4.0.6；蛋白編碼基因預測及評估：Genscan，Augustus v2.4，GlimmerHMM v3.0.4，GeneID v1.4，SNAP（version 2006-07-28），GeMoMa v1.3.1，PASA v2.0.2，EVM v1.1.1；非編碼RNA預測：tRNAscan-SE v1.3.1；假基因預測：GenBlastA v1.0.4，GeneWise v2.4.1；基因功能和motif注釋：BLAST v2.2.31，BLAST2GO，InterProScan；結構變異檢測：MUMmer4；共線性分析：MCScanX；選擇壓力分析：PAML v4；

主要研究結果

1、系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究利用來自中國和日本的48份WRAH種系，43份與WRAH共存的溫帶粳稻品種（Japonica-C），26份中國溫帶粳稻品種（Japonica-L），四個典型的栽培稻亞群（12tropical?japonica，145?indica/xian,，11?aus和?3?aromatic），15份來自中國南方中緯度雜草稻（WRSC）以及已經發(fā)表了全基因組SNP信息的30份野生祖先種，基于SLAF-seq共檢測到122,777個高質量SNP，叫做122k-SNP，用于系統(tǒng)發(fā)育樹的構建（見圖1）。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，WRAH在系統(tǒng)發(fā)育上不同于Japonica-C，并且與溫帶粳稻Japonica-L群體形成了明確分群；WRSC種質與秈稻種質劃分到一個亞群。

圖1 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

2、基因組測序、組裝及注釋

本研究基于單分子實時測序（SMRT）、高通量NGS和染色質構象捕獲（Hi-C）技術組裝了高質量的亞洲高緯度雜草稻WR04-6基因組。最終組裝出染色體水平的高質量基因組，包含12條染色體，大小為373.93Gb，contigN50位6.09Mb。最后，去除重復序列后通過從頭預測、同源預測和RNA-seq分析共獲得41,385個基因，有96.32%的基因在NR，KOG,，GO，KEGG，TrEMBL數據庫中得到了注釋（見圖3）。

圖3 Hi-C輔助基因組組裝熱圖

圖4 雜草稻基因組分布圖

3、比較基因組分析

利用OrthoMCL軟件檢測WR04-6、R498、Nipponbare和W1943（O. rufipogon）間核心的、非必須的和共有的基因家族。在WR04-6中鑒定到了909個擴張的基因家族，并且通過通路分析顯示，這些基因在光合作用和呼吸作用中顯著富集（p<0.01），例如氧化磷酸化、光合作用和核糖體的KEGG途徑，考慮其可以作為遺傳改良的信號。以O. barthii作為外群構建的進化樹顯示WR04-6與粳稻祖先的分化時間估計在3,706ya（1,235ya-6,326ya），見圖4。

圖4 以O. barthii作為外群構建的最大似然樹

參考文獻：Sun J, Ma D, Tang L, et al. Population Genomic Analysis and De novo Assembly Reveal the Origin of Weedy Rice as an Evolutionary Game[J]. Molecular plant, 2019.

 

英文題目：A Chromosome-Scale Genome Assembly of Paper Mulberry (Broussonetia papyrifera) Reveals the Genetic Basis of Its Forage and Papermaking Usage.

中文題目：染色體水平的基因組揭示構樹飼用和造紙的遺傳基礎

發(fā)表期刊：Molecular Plant

發(fā)表時間：2019年2月

合作單位：中國科學院植物研究所北方資源植物重點實驗室

研究方法：基因組、比較基因組等

研究背景

構樹（Broussonetia papyrifera，2n=2x=26）屬于?？疲?em>Moraceae）構屬（Broussonetia）多年生喬木，是我國鄉(xiāng)土樹種和先鋒植物，有悠久的歷史和文化，因為蔡倫用它造紙而世界聞名。構樹的樹皮和樹干是造紙的優(yōu)質原料，樹葉還可以作為蛋白飼料，其根、莖、葉、果實及種子均可入藥，富含黃酮類化合物；還是尾礦處理、生態(tài)綠化的理想樹種。然而，有關構樹的研究主要集中于造紙、藥理藥化、養(yǎng)殖以及生態(tài)綠化等應用方面，基礎生物學的研究很少。因此，構樹栽培改良的第一步是獲得其遺傳背景，以便能更好地掌握其特有特征的生物學機制。

材料選擇

生長5年的雌性構樹用于基因組測序；基因組測序的雌性構樹與未知雄性構樹雜交，獲得包含120個F1個體的CP群體用于構建遺傳圖譜輔助基因組組裝。

測序策略：Illumina Hiseq和PacBio

分析軟件：

基因組組裝注釋：基因組組裝：?ALLPATHS-LG，SSPACE，GapCloser，BioNano Genomics?，RefAligner，LoRDEC，Pbjelly，MAPS，ALLMAPS；Hi-C輔助基因組組裝：Hi-C-Pro，LACHESIS；基因組注釋：RepeatMasker (version open-4.0.5)，PILER (version 1.0)，RepeatScout (version 1.0.5)，LTR-finder，MITE，PASTEClassifer，PASA，AUGUSTUS（vertion 3.0.3），SNAP，GlimmerHMM，GeneID，Genescan (version 1.1.0)，），Genewise (version 2.2.0），TopHat2 (version 2.0.7)，Cufflinks (version 2.2.1)，GeneMarkS-T (version 5.1)，?Genewise；基因功能注釋，InterProScan (version 5)，Hmmscan (HMMER, version 3.0)，BLAST2GO (version 2.5)，BLASTP，Trembl，tRNAscan-SE (version 1.3.1)，Infernal cmscan (version 1.1.1)。

比較基因組分析：直系同源基因鑒定：?OrthoMCL (version 2.0)；系統(tǒng)發(fā)育樹構建與分化時間估算：?MUSCLE、Gblocks (version 0.91b)和RaxML（version 8），MCMCTREE評估分化時間；基因家族擴張和收縮分析：CAFE（vertion 3.1）；染色體共線性分析、4DTV檢測及Ks值計算：MCscan。

主要研究結果

1、基因組組裝與注釋

本研究使用Illumina HiSeq和PacBio Sequel測序平臺，用Hi-C、光學（BioNano Irys）和遺傳圖譜輔助，進行雌性構樹的基因組組裝。獲得染色體水平的高質量構樹基因組，其大小為386.93Mb，scaffold N50是29.48Mb，有99.25%（357.56Mb）的基因組被錨定在13條染色體上，Hi-C熱圖評估（見圖1）。一共預測了30,512個基因，98.09%與已知基因同源并且得到了功能上的注釋。

圖1 熱圖驗證Hi-C輔助染色體組裝

??圖2 構樹染色體分布圖

2、構樹的基因組進化

利用14個物種（無油樟、亞麻、毛楊、棉花、擬南芥、黃瓜、苜蓿、桑樹、構樹、桃樹、葡萄、番茄、毛竹和玉米）的單拷貝直系同源基因構建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現構樹與桑樹在同一分支，在大約3100萬年前與桑樹分開，與桃子的分化時間在大約7800萬年前（見圖3），該結果被4DTv的分析結果所證實，通過Ks分析進一步得到證實。

圖3 14個物種的系統(tǒng)發(fā)育樹

根據已報道的雙子葉植物祖先和譜系特異性WGD，本研究推測，古六倍化始祖的21條染色體至少經歷了11次大的染色體融和（cfus）和2次染色體裂變后產生了?？浦虚g狀態(tài)的12條始祖染色體（見圖4）。?？频氖甲嫒旧w的數目與葫蘆科和楊柳科是相似的，但是與薔薇科（n = 9）、豆科（n = 6）、錦葵科（n = 16）和茄科（n = 16）是不同的。進化推演分析表明，構樹的染色體是從?？频?2條始祖染色體經27次融合和28次裂變重構的，說明構樹基因組在進化過程中至少經歷了68次的染色體融合和裂變。

圖4 構樹和其他6種植物基因組重構的進化推演

3、比較基因組分析

在構樹基因組中共發(fā)現15,254個基因家族，與桑樹分化之后，有431個基因家族擴張，230個基因家族收縮，表明在適應進化過程中，構樹中更多的基因家族經歷了擴張而不是收縮。另外，與苜蓿、毛楊和甜橙相比，轉錄因子發(fā)生明顯收縮（58個家族共1,342個轉錄因子，占蛋白編碼基因的4.4%）。肌動蛋白在植物的生長和發(fā)育的很多層面扮演著重要的角色，在酵母和很多動物中，肌動蛋白僅被一個單基因編碼。在構樹中僅發(fā)現4個肌動蛋白，少于藻類、小立碗蘚和無油樟。

參考文獻：Peng X, Liu H, Chen P, et al. A Chromosome-Scale Genome Assembly of Paper Mulberry (Broussonetia papyrifera) Provides New Insights into Its Forage and Papermaking Usage[J].?Molecular plant, 2019.

百邁客HI-C研究優(yōu)勢百邁客自2016年初以來，利用Hi-C技術進行染色體水平的基因組組裝及染色體三維構象的研究，成功開發(fā)出六堿基、四堿基酶切方案，組裝、互作輕松拿下。在植物Hi-C領域，更是邁進了一大步，在同行還只能處理植物活體樣本的時候，我們已經可以輕松“駕馭”離體枝條。迄今為止，保持著近100%的建庫成功率，完成近300個物種，近千個文庫構建；文庫含酶切位點的有效數據比例最高達93%以上，平均比例高達68%。另外百邁客在Hi-C技術方面獲得一個專利和兩個軟著。Nature Genetics、Nature Communications、Molecular Plant等一大波Hi-C的高分文章在審稿或已接收的路上，后續(xù)會陸續(xù)與大家見面，敬請期待~~

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摘要概述

A high-quality, chromosome-scale Tartary buckwheat genome sequence of 489.3 Mb is assembled. A new buckwheat lineage-specific whole genome duplication is discovered. The reference genome facilitated the identification of many new genes predicted to be involved in rutin biosynthesis and regulation,aluminum stress resistance, and in drought and cold stress responses.

研究背景

苦蕎也叫苦蕎麥（Fagopyrum tataricum）是蓼科蕎麥屬作物，雖然我們習慣認為它屬于麥類，但其實他并非禾本科而是蓼科?？嗍w性喜陰濕冷涼，多種植于高山地域，一般垂直分布為海拔1200～3500m。所以苦蕎具有很高的抗逆性，尤其是在抗寒和抗干旱方面?？嗍w是藥食兩用的作物，苦蕎麥性味苦、平、寒, 有益氣力、續(xù)精神、利耳目、降氣寬腸健胃的作用。能降血壓、降血糖、降血脂, 改善微循環(huán)等作用, 又稱“三降”食品。其主要藥用成分為蘆丁，該文章也對蘆丁的生物合成進行了研究。

測序材料

韃靼蕎麥（Fagopyrum tataricum cv. Pinku1），2n=2X=16；

測序方法

Illumina、BioNano、PacBio、Hi-C、fosmid

研究內容

1.基因組組裝和注釋
苦蕎通過K-mer預估基因組大小約為489Mb，流式細胞儀預估為540Mb。共組裝出來489.3Mb的基因組序列，共8778個Contigs，Contig N50=550.7kb。通過Hi-C數據將436.4Mb的序列錨定到8條染色體上（定位比例為89.18%）。然后再通過光學圖譜數據進行校正。三代數據的準確性通過二代評估為99.96%，并且在基因區(qū)具有更少的錯誤存在。

共預測得到33366個基因，平均每100Kb具有6.8個基因。非編碼RNA注釋結果為278 miRNAs, 1,395 tRNAs, 455 rRNAs, and 518 snRNAs。通過注釋已組裝基因組的50.96%為重復序列，其中LTR的比例占全基因組的38.64，包含Gypsy (30.52%) 和 Copia (5.48%)。

圖1 苦蕎基因組circle圖

2.系統(tǒng)發(fā)育和全基因組復制事件分析
苦蕎與擬南芥、可可、大豆、葡萄、楊樹、馬鈴薯、番茄以及單子葉的水稻和玉米構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，見下圖。此外還進行基因家族聚類分析，找出共同和特有的基因家族。

圖2 苦蕎系統(tǒng)發(fā)育進化樹

通過苦蕎與擬南芥、苦蕎與甜菜進行分析，通過Ks計算發(fā)現苦蕎經歷了全基因組復制事件，近期是在下圖0.84-0.92之間，而更古老的一次復制發(fā)現在64.42~70.77 Mya。而全基因組復制事件的發(fā)生，也導致了很多與抗逆相關基因家族的擴張或者保留。這也與后期苦蕎的抗逆性有一定關系。

圖3 苦蕎全基因組復制事件

3.參與蘆丁合成基因的鑒定
蘆丁的生物合成具有特殊的意義，而苦蕎被認為是這種有益的類黃酮的主要食物來源?？喔墒w麥營養(yǎng)生物質中含有3%的蘆丁。通過比較基因組以及不同生長部位的轉錄組測序，發(fā)現原來所不知道的全長蛋白CHI(FtPinG0002790600)和f3h(FtPinG0006662600)。

圖4 蘆丁生物合成途徑的研究

4.苦蕎抗逆性研究
該研究還發(fā)現苦蕎中存在大量與植物耐鋁、抗旱和耐寒相關的新基因，其中產物包括一些轉運蛋白以及相關的轉錄因子。

小編總結

本文研究了苦蕎的基因組測序，除了三代測序還通過光學圖譜和Hi-C技術進一步提升基因組的組裝質量。通過比較基因組學研究明確了苦蕎的系統(tǒng)發(fā)育地位，以及通過全基因組復制事件的研究發(fā)現了抗逆基因的擴張和保留。其中結合轉錄組測序對蘆丁的生物合成途徑進行了研究。

該研究由山西農科院農作物品種資源研究所喬治軍研究員團隊聯(lián)合中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所梁承志研究員團隊及華南農農業(yè)大學王俊教授團隊共同完成，其中百邁客只參與了其中部分研究，再次祝賀各位老師取得好的成績。

參考文獻

The Tartary buckwheat genome provides insights into rutin biosynthesis and abiotic stress tolerance.