研究背景

枯葉提取法是一種新型的高羊茅鎘植物修復(fù)策略，為鎘污染土壤的植物修復(fù)和清潔食品生產(chǎn)提供了可行性。枯葉中Cd含量最高是葉片衰老過程中Cd積累的結(jié)果。然而，葉片衰老過程中Cd積累的機(jī)理尚不清楚，這限制了該技術(shù)的提取效率。本研究通過RNA-seq組學(xué)研究技術(shù)對高羊茅葉片Cd積累的內(nèi)部機(jī)制。

研究方法

根據(jù)葉片在美洲虎羊茅莖中的位置進(jìn)行取樣和分離。L1為頂部初生葉，L2和L3為上部2、3個(gè)成熟葉片，L4是衰老開始時(shí)的葉片；L5是衰老的黃色葉片。

分別用75μMCd和不加75μMCd處理高羊茅幼葉(L1)和衰老葉(L4)7d(L1-con、L4-con、L1-Cd、L4-Cd)，并進(jìn)行3次生物重復(fù)，提取總RNA并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。（測序工作由北京百邁客公司提供技術(shù)支持）。

研究結(jié)果

一、不同葉片中的鎘、游離氨基酸、可溶性糖和金屬硫蛋白測定

不同葉片Cd積累量顯著不同。葉片Cd濃度隨葉片數(shù)量的增加從上到下顯著增加，L2、L3、L4和L5的Cd濃度比幼葉(L1)增加了2.1、2.3、2.5和5.1倍。幼葉(L1)積累Cd最少，而衰老葉(L5)積累Cd最多。Cd處理顯著提高了各葉片游離氨基酸含量，但沒有改變其隨葉片衰老逐漸下降的趨勢，幼葉中游離氨基酸含量(L1)最高，然后隨著葉片衰老逐漸降低(圖1B)。衰老葉(L5)中游離氨基酸含量最低。成熟葉片中可溶性糖含量(L2)最高，Cd處理顯著提高了L2和L4的可溶性糖含量，然后隨著葉片衰老逐漸降低。衰老葉(L5)和幼葉(L1)的可溶性糖含量顯著低于綠色成熟葉。鎘脅迫下,與對照組相比，Cd處理顯著提高了所有葉片中的金屬硫蛋白含量，不同葉片金屬硫蛋白含量無顯著變化。

Cd脅迫對高羊茅不同葉片Cd(A)、游離氨基酸(B)、可溶性糖(C)和金屬硫蛋白(D)含量的影響

二、鎘處理對不同葉片間螯合物的影響

PC、GSH和NPT參與了超積累劑的Cd解毒機(jī)。Cd脅迫和對照組的植物螯合素(PCs)均隨葉片老化顯著增加。Cd處理顯著提高了各葉片PC含量，非蛋白硫醇(NPTs)含量也隨著葉片衰老而顯著增加，但隨葉片衰老的增加趨勢沒有變化。Cd處理顯著增加了衰老葉片(L4和L5)的谷胱甘肽(GSH)含量，但沒有提高幼苗和成熟苗的GSH含量。由此可以推斷，GSH、PC和NPT的增加及其與Cd的結(jié)合可能促進(jìn)了衰老葉片中Cd的積累。Cd處理顯著增加了幼葉和成熟葉的氧化谷胱甘肽(GSSH)含量(L1和L2)，但降低了衰老葉(L5)的GSSH含量。由于氧化后的谷胱甘肽(GSSH)可被還原為還原型谷胱甘肽(GSH)，還原性谷胱甘肽(GSH)可以通過GST進(jìn)一步催化GSH-Cd結(jié)合，GSSH向GSH的轉(zhuǎn)化與Cd在衰老葉片中的積累是一致的。

Cd脅迫對高羊茅不同葉片螯合素(PCs)、非蛋白硫醇(NPTs)、還原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSH)含量的影響

三、差異基因的鑒定和GO分析

為了更好地了解Cd在葉片衰老過程中的積累機(jī)制，利用RNA-seq研究了Cd處理前后幼葉(L1)和衰老葉(L4)的轉(zhuǎn)錄組譜。對L1-ConvsL4-Con、L1-CdvsL4-Cd、L1-convsL1-Cd和L4-convsL4-Cd的比較組根據(jù)轉(zhuǎn)錄水平至少有兩倍差異進(jìn)行篩選，分別發(fā)現(xiàn)的差異基因數(shù)目為2286、4270、1808、1929。在這些差異基因中，與Cd脅迫相比，L1和L4中有157個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，255個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。四個(gè)比較組的共有24個(gè)上調(diào)基因和20個(gè)下調(diào)基因。采用qRT-PCR方法，從RNA-seq數(shù)據(jù)的差異基因中隨機(jī)選取12個(gè)基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析。這12個(gè)基因在qRT-PCR分析結(jié)果和RNA-seq數(shù)據(jù)中均顯示出相同的表達(dá)模式。

為了了解差異基因的功能，作者進(jìn)行了GO富集分析。四組的差異基因在節(jié)律過程、信號傳導(dǎo)和代謝過程等生物過程中都有20個(gè)豐富的分類。值得注意的是，與對照組相比，脫毒組的差異基因在幼葉和衰老葉中都有富集(L1-ConvsL1-Cd和L4-ConvsL4-Cd)，但在幼葉和衰老葉的對照組和處理組中沒有明顯富集（L1-CdvsL4-Cd和L1-ConvsL4-Con）。

鎘脅迫下幼葉和衰老葉片基因表達(dá)譜的變化

四、KEGG通路分析

為了進(jìn)一步了解Cd處理下高羊茅葉片中Cd積累的機(jī)制，利用KEGG對葉片中的差異基因進(jìn)行富集分析。在幼葉中，主要富集的途徑是晝夜節(jié)律-植物、苯丙氨酸代謝、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙素生物合成、淀粉和蔗糖代謝，而在衰老葉片中，差異基因主要富集于類胡蘿卜素的生物合成、晝夜節(jié)律與植物的關(guān)系、谷胱甘肽的代謝、植物與病原菌的相互作用以及苯丙素的生物合成等代謝途徑。苯丙素類生物合成和晝夜節(jié)律型植物的基因在幼葉和衰老葉中都表現(xiàn)豐富。值得注意的是，屬于谷胱甘肽代謝途徑的基因僅在衰老葉片中表現(xiàn)出富集。

差異基因的KEGG途徑富集分析

五、衰老葉片中谷胱甘肽代謝途徑與Cd結(jié)合

通過比較分析幼葉和衰老葉片對Cd脅迫的響應(yīng)，有助于探索衰老葉片中Cd積累的關(guān)鍵調(diào)控基因，作者進(jìn)一步比較了對照組組和Cd處理組在“谷胱甘肽代謝”途徑中的差異基因表達(dá)。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)是催化GSH-Cd偶聯(lián)的酶，植物GSTs可以進(jìn)行GSH依賴的反應(yīng)來進(jìn)行Cd解毒。在該轉(zhuǎn)錄組中，共鑒定出了26個(gè)基因編碼GST。其中，19個(gè)上調(diào)基因在Cd脅迫下的差異倍數(shù)高于對照組。結(jié)果表明，GST基因的上調(diào)和S-谷胱甘肽的結(jié)合可能參與了衰老葉片中Cd的積累。

MT（金屬硫蛋白）是一組金屬結(jié)合蛋白，在金屬分配和穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用。1個(gè)上調(diào)基因(c129583.Graph_c0)和一個(gè)下調(diào)基因(c120767.graph_c0)編碼MT。Cd脅迫使上調(diào)基因的差異倍數(shù)比對照增加了23.8%，并完全抑制了表達(dá)下調(diào)的基因。結(jié)合Cd脅迫下MT含量的增加，作者的研究結(jié)果表明，MT-Cd結(jié)合可能在幼葉(L1)和衰老葉片(L4)的Cd解毒過程中發(fā)揮作用。半胱氨酸蛋白酶(CPs)是葉片衰老過程中負(fù)責(zé)蛋白水解活性的最豐富的酶。在該轉(zhuǎn)錄組中鑒定出17個(gè)編碼CP的基因。在對照組中，只有4個(gè)基因的表達(dá)有顯著差異。Cd脅迫顯著促進(jìn)CP表達(dá)，有10個(gè)上調(diào)基因在Cd處理組的差異倍數(shù)高于處理組，Cd處理組的6個(gè)基因下調(diào)倍數(shù)低于對照組。然而，PC的蛋白水解活性是否與衰老葉片中Cd的積累有關(guān)尚不清楚。

與谷胱甘肽代謝和Cd結(jié)合相關(guān)的基因在幼葉(L1)和衰老葉(L4)與Cd脅迫或不脅迫下的轉(zhuǎn)錄變化

總結(jié)

從枯葉中提取Cd的策略取決于葉片衰老過程中Cd的積累機(jī)制。研究葉片衰老過程中Cd在枯葉中優(yōu)先積累的機(jī)理至關(guān)重要。本研究通過轉(zhuǎn)錄組和化學(xué)分析表明，葉片衰老過程中Cd的積累與PC、GSH和NPT結(jié)合Cd有關(guān)。Cd結(jié)合PC、GSH、NPT的增加可能來自于蛋白質(zhì)降解的途徑。作者的研究結(jié)果為揭示葉片衰老過程中Cd積累的調(diào)控機(jī)制提供了依據(jù)。在高羊茅蛋白質(zhì)降解過程中，通過促進(jìn)PC、GSH、NPT與Cd的結(jié)合，可進(jìn)一步提高高羊茅枯葉提取效率。