英文名:?Integration of full-length transcriptomics and?targeted metabolomics to identify?benzylisoquinoline alkaloid biosynthetic genes in?Corydalis yanhusuo
雜志：Horticulture Research
影響因子：5.404
研究背景
延胡索( Corydalis yanhusuo W.T. Wang) ，別名元胡，罌粟科紫堇屬多年生草本植物，常以其干燥塊莖入藥，是世界上具有低成癮性和耐受性的鎮(zhèn)痛中藥，鎮(zhèn)痛效價約為嗎啡的60%。四氫巴馬汀和左旋紫堇達明已被確認為延胡索中具有鎮(zhèn)痛活性成分，可作為阿片類鎮(zhèn)痛藥的替代品，但含量低下，產量較小的缺點制約著該類藥物的應用。
研究目的
對合成原小檗堿型芐基異喹啉生物堿的相關基因進行了挖掘，為后期利用合成生物學與植物代謝工程生產延胡索中具有鎮(zhèn)痛效果的痕量化合物奠定了基礎。
材料方法
延胡索，成熟期的葉和塊莖，道地產區(qū)浙江磐安
代謝：UPLC-Q-TOFMS定性定量
轉錄組：二代+三代全長轉錄組測序
研究結果
1、轉錄組和代謝組測序分析
該研究以來自道地產區(qū)浙江磐安的延胡索成熟期的葉和塊莖為研究對象，采用UPLC-Q-TOFMS定性定量分析了延胡索中具有鎮(zhèn)痛活性的成分，并通過二代校準的三代全長轉錄組測序的方法對合成原小檗堿型芐基異喹啉生物堿的相關基因進行了挖掘。
延胡索提取物的塊莖和葉組QTOF-MS數(shù)據(jù)的代謝組學多元分析
延胡索塊莖和葉片之間基因的差異表達
2.、轉錄組-代謝組聯(lián)合分析
對處于不同器官的組織樣品進行了轉錄組-代謝組聯(lián)合分析，最終鑒定到了101個參與芐基異喹啉生物堿(benzylisoquinoline alkaloid,BIA)生物合成途徑的unigenes和38種在延胡索葉與塊莖中含量具有顯著差異的代謝物，并對其中19種典型的代謝物進行了器官差異性豐度測定。結果顯示，目前已知的合成途徑在延胡索中報導過的BIAs合成途徑中均成功對應到至少一種關鍵合成酶的unigene，說明BIA的空間分布差異主要受到轉錄水平上的調控。
芐基異喹啉生物合成途徑
3、 OMT蛋白家族系統(tǒng)發(fā)育樹分析
進一步研究發(fā)現(xiàn)，其中參與合成具有廣泛臨床鎮(zhèn)痛潛力的關鍵代謝物四氫巴馬汀的酶可能與唯一已知的黃連中負責催化這一步反應的ColumbamineO-methyltransferase(CoOMT)存在較大的蛋白質序列差異。通過系統(tǒng)發(fā)生樹分析，作者們推斷出至少存在10種unigenes的翻譯產物可能催化四氫巴馬汀的合成。 特異性的氧甲基化是四氫巴馬汀與紫堇達明合成的關鍵，延胡索中是否存在特殊的一類OMT或者具有不同底物特異性的OMT則是接下來將要重點解析的重點。
OMT蛋白家族系統(tǒng)發(fā)育樹
文章亮點
本研究明確了鎮(zhèn)痛成分的生物合成機制，同時為進一步生化水平上的活性驗證提供了方向，且為后期延胡索功能基因組的解析奠定基礎。
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]]>食品是非常復雜的基質，含有數(shù)千種成分，是動植物代謝的結果。食品成分在加工前、加工過程中和加工后都受到外部因素的影響。食品品質已成為肉品行業(yè)的主要關注點之前。對質量的評估包括香氣、風味、營養(yǎng)和色澤等多個方面，需要通過不同的方法來進行評估，使得方法及其復雜。而基于質譜的代謝組學方法信息豐富，可以獲取代謝物的信息，將其特性和食品品質關聯(lián)一起，為解決這復雜問題提供了支撐。
01、輻照對絞肉代謝組學特征的影響及其對食品安全的影響
輻照是一種高效滅菌方法，對肉類保存具有重要作用。本研究基于定性非靶向?HPLC-Orbitrap?代謝組學方法，旨在估計輻照雞肉、火雞和混合（雞肉、火雞和豬肉）絞肉的全局代謝組譜變化，以評估可能存在的食品安全關于代謝組改變的問題。通過LC-MS共鑒定了?402?種代謝物，并且所有三種基質都表現(xiàn)出特定的代謝組譜，該譜組不受應用五種不同輻照強度水平的顯著影響。特別是，所有三個肉類類別都顯示出以下共同特征：
1)?游離氨基酸庫不受輻射影響
2)??；撬崴坪跏撬腥?重要的區(qū)別因素
3)?谷胱甘肽的含量減少
4)?發(fā)生輕微的多不飽和游離脂肪酸的氧化修飾
5)?強化的腺苷核苷酸降解。所提出的分析方法強調了肉類代謝組分析在區(qū)分輻照肉類和未處理肉類方面的有用性。
02、動物友好型飼養(yǎng)環(huán)境對雞大腿肉品質、儲存穩(wěn)定性和代謝組學特征的影響
本研究使用基于核磁共振的代謝分析，調查了合法批準的動物友好型飼養(yǎng)環(huán)境對雞大腿肌肉理化質量和儲存穩(wěn)定性的影響。一天大的?Cobb?小雞在室內系統(tǒng)中的常規(guī)或動物友好型農場飼養(yǎng)?35?天。將來自傳統(tǒng)農場?(CB)?的雞大腿肉和來自合法批準的動物友好型農場?(AFB)?的雞大腿肉儲存?7?天，并分析肉類的代謝組學特征和特征。基于它們的代謝組學特征，通過偏最小二乘判別分析清楚地分開了兩組雞。糖酵解相關產物（葡萄糖和乳酸）在?AFB?中更豐富，而肌苷、次黃嘌呤和游離氨基酸在?CB?中的含量更高。動物友好的飼養(yǎng)環(huán)境導致AFB的代謝途徑和理化質量的差異調節(jié)，與CB相比，其pH和持水能力較低，剪切力較高。然而，兩組雞在微生物質量、脂質氧化、揮發(fā)性堿性氮和脂肪酸譜方面都保持了儲存穩(wěn)定性。這些結果表明，動物友好的飼養(yǎng)環(huán)境可能通過代謝變化導致肉質的差異。
03、基于質譜的代謝組學揭示添加中鏈單酸甘油酯對雞肉的改善作用：味道、鮮肉質量和成分
本研究旨在揭示中鏈甘油單酯?(MG)?補充劑引起的雞肉鮮肉質量、成分和味道的差異。結果表明，添加?MG?可改善雞湯和肉味。上調升-carnosine，肌氨酸，尿苷和促成了鮮味和肉味的MG組的雞湯煙酰胺。膳食MG增加了雞胸肉肌肉中的總超氧化物歧化酶活性和氨基酸含量，并降低了丙二醛含量和滴水損失。此外，肉類代謝組顯示肌酸、甜菜堿、l-鵝肌氨酸、肌苷?5′-單磷酸、次黃嘌呤、肌苷和磷脂，以及氨基酸和嘌呤代謝途徑，與通過添加?MG?改善肉雞的肉質、成分和味道有關?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)提供了證據(jù)，證明添加?MG?可以改善肉雞的鮮肉質量、成分和味道。
04、基于?LC-MS?的代謝組學揭示了山羊肉輻照過程中代謝物的動態(tài)變化
本研究應用LC-MS非靶向代謝組學方法來鑒定輻照山羊肉的化學成分，并研究輻照對其代謝特征的影響和肉質。共有?103?種代謝物被確定為負責輻照山羊肉代謝變化的差異代謝物，它們參與苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、苯丙氨酸代謝和嘌呤代謝。包括氨基酸、核苷酸及其衍生物的差異代謝物被確定為輻照過程中肉質的鑒別因素。具體而言，L-苯丙氨酸、L-異亮氨酸、L-組氨酸、鳥苷、鳥嘌呤、肌酐、谷胱甘肽和煙酸增加，而肌苷?5′-單磷酸?(IMP)?和鳥苷?5′-單磷酸?(GMP)?減少。總體而言，除?L-苯丙氨酸和鳥嘌呤外，其他相關代謝物均隨儲存顯著減少。本研究有助于從分子水平全面了解輻照劑量和貯藏時間對山羊肉代謝的影響，從而評價輻照山羊肉的質量。線性度令人滿意的結果?(R2??>?0.995)、精密度（RSD小于8.9%）和回收率（83%-106%），表明非靶向代謝組學方法適用于監(jiān)測輻照山羊肉中小分子代謝物的變化，輻照是可行的山羊肉的保鮮方法。
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參考文獻：
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背景介紹
在NAFLD患者體中，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)血漿中氨基酸的濃度增加，特別是支鏈氨基酸。然而，這一現(xiàn)象也可能是由于肌肉蛋白質分解增加，肥胖和/或胰島素抵抗（IR）增加或是由于受損的組織代謝導致，其具體機制尚未可知。
發(fā)表在Hepatology（IF=14.079）上的Altered amino acid concentrations in NAFLD: impact of obesity and insulin resistance?通過一組代謝組數(shù)據(jù)和病理數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)：氨基酸血漿濃度的增加主要在肥胖的NAFLD受試者中出現(xiàn)，這可能是胰島素抵抗（IR）和蛋白質分解代謝增加的結果。
實驗設置
44例非糖尿病的NAFLD患者（29例非肥胖，15例肥胖），20例健康人（CT）。禁食過夜后收集血樣以測量肝酶活，脂質含量，葡萄糖濃度，游離脂肪酸含量，胰島素抵抗，氨基酸含量。
結果
1.?研究對象的臨床特征
使用GC-MS檢測血漿中氨基酸含量，NAFLD患者血漿中異亮氨酸和纈氨酸（支鏈氨基酸），酪氨酸（芳香族氨基酸），丙氨酸，賴氨酸和谷氨酸含量較高，而血漿甘氨酸濃度顯著下降。大部分患者的BMI小于30 kg/m2，然而，大多數(shù)氨基酸僅在NAFLD-Ob（肥胖的NAFLD患者）中增加。與CT相比，NAFLD-NO（非肥胖的NAFLD患者）中只有丙氨酸、谷氨酸、異亮氨酸和纈氨酸濃度增加。另外，患者有更高的肝酶活（ALT、GGT、AST）。
表1 血漿氨基酸濃度
2.?GSG指數(shù)
這些氨基酸以某種方式參與合成谷胱甘肽（GSH）和脂毒性相關的脂質前體。 因此，我們測試了GSG指數(shù)與肝臟組織學改變的相關性，其中GSG-index指數(shù)計算了[Glutamate/(Serine+Glycine)]。
我們發(fā)現(xiàn)與CT相比，NAFLD患者的谷氨酸濃度明顯更高，甘氨酸濃度更低。?與CT相比，NAFLD-NO中的GSG指數(shù)更高，而NAFLD-Ob中更高。?由于轉氨基作用， GSG指數(shù)與肝酶活緊密相關，尤其是和γ-谷氨酰轉移酶GGT緊密相關。GSG指數(shù)也和支鏈氨基酸相關，尤其是亮氨酸，說明谷氨酸脫氫酶作用增加。單獨的谷氨酸也以較弱的方式與肝功能試驗（LFTs）相關，而LFTs與構成GSG指數(shù)的其他氨基酸（甘氨酸或絲氨酸）的濃度之間未發(fā)現(xiàn)相關性。
?圖1 GSG指數(shù)與肝酶活相關性
3.?氨基酸和胰島素抵抗IR
肝胰島素抵抗（Hepatic-IR）反映胰島素不能抑制空腹內源性葡萄糖生，HOMA-IR能同時反映肝臟和外周的胰島素抵抗。我們檢測肥胖與非肥胖NAFLD的IR程度是否不同，以及與CT相比，肥胖與非肥胖NAFLD的氨基酸濃度有何不同。
只有少數(shù)氨基酸與Hep-IR顯著相關。 甘氨酸和組氨酸與Hep-IR具有顯著的負相關。而谷氨酸和酪氨酸與Hep-IR發(fā)現(xiàn)正相關，只有酪氨酸與HOMA IR相關。外周胰島素敏感性僅與酪氨酸相關。GSG指數(shù)與Hep-IR相關，稍微與HOMA-IR相關，但與外周胰島素敏感性無關。 芳香族氨基酸與Hep-IR，HOMA-IR和外周胰島素敏感性相關，但僅僅因為酪氨酸。通過使用多變量分析，我們評估了BCAA，AAA和GSG指數(shù)中哪些與Hep-IR和HOMA-IR獨立相關，并發(fā)現(xiàn)GSG指數(shù)和AAA與Hep-IR獨立相關，而只有AAA與HOMA-IR獨立相關。
4.?氨基酸作為肝臟炎癥和纖維化的標志物
我們首先檢測肝臟炎癥和氣球樣變時哪些氨基酸的濃度改變。相比于對照組，氣球樣變2級的患者血漿中BCAA、AAA、谷氨酸，丙氨酸和賴氨酸含量增加，而甘氨酸和蘇氨酸濃度下降。 氨基酸濃度也與肝纖維化增加有關，但在纖維化評分為3和4的NAFLD中觀察到的濃度與纖維化評分為0-2的患者沒有顯著差異。
用于計算GSG指數(shù)的氨基酸在某種程度上參與GSH的合成和脂毒性相關的脂質前體合成。因此，我們測試了GSG指數(shù)是否與肝臟組織學的改變相關?；加蠳AFLD的受試者具有更高的GSG指數(shù)，而與肝臟活組織檢查中存在的氣球樣或炎癥無關。GSG指數(shù)隨肝纖維化程度顯著增加，特別是F3-4嚴重纖維化。
圖2 不同肝氣球樣變程度中氨基酸含量
小結
本文選取對照組、肥胖患病組、非肥胖患病組，通過代謝組檢測血漿中氨基酸含量，并結合臨床病理數(shù)據(jù)，建立了GSG指數(shù)模型，更加準確的檢測NAFLD患者肝病程度，并且排除肥胖等因素的干擾。結果表明：AA血漿濃度的增加主要在肥胖的NAFLD受試者中出現(xiàn)，這可能是IR和蛋白質分解代謝增加的結果。GSG指數(shù)可以作為肝臟疾病嚴重程度的新標志物。
代謝物是疾病發(fā)展的直觀體現(xiàn)，通過代謝組檢測能夠更加直接有效的揭示體內變化情況。目前氨基酸高通量靶標代謝組、游離脂肪酸高通量靶標代謝組、短鏈脂肪酸高通量靶標代謝組、膽汁酸高通量靶標代謝組、脂質代謝組在醫(yī)學研究中有廣泛應用。大量的文章也會將轉錄組、微生物多樣性與代謝組關聯(lián)分析，深入闡釋疾病發(fā)生發(fā)展的機制，為基礎研究、臨床診斷提供新的研究思路。
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對缺失值的處理，簡單粗暴的方法是直接去除所有含有缺失的代謝物，對于一些代謝物如果是在樣本中大量缺失（比如超過了50%）確實可以舍棄，而少量缺失如果丟棄則可能會丟失一些有重要生物學意義的代謝物，所以對于少量缺失，較為穩(wěn)妥的辦法就是用值填補。比較簡單的方法是用0值、均值、中值或最小值的一半進行填補，復雜一點的則是使用機器學習的算法如鄰近算法（KNN）、隨機森林（RF）、奇異值分解（SVD）等方法。由于代謝組目前可分為靶向和非靶向兩大類型，在不同的類型中往往是采取不同的處理辦法。有研究者認為非靶向的推薦使用KNN算法（Do et al.,2018）；也有認為GC-MS數(shù)據(jù)使用隨機森林方法（Gromski et al.,2014）；還有的則認為需要按缺失類型，對于完全非隨機缺失的可使用最小值的一半進行填補，完全隨機缺失或隨機缺失的使用隨機森林方法（Wei et al.,2018）。所以目前沒有統(tǒng)一的標準。
標準化主要是為了去除實驗、技術等帶來的誤差，常見的方法有：內標，即代謝物除以內標豐度，可用于GC-MS；總峰面積標準化，即代謝物除以所有代謝物的總峰面積，可用于非靶向LC-MS；對數(shù)變換即直接對豐度取對數(shù)，LC-MS和GC-MS都有用到；PQN （Probabilistic Quotient Normalization）即每個代謝物除以了一個稀釋因子，這個因子則是依賴于樣本與參考樣本比值的分布，在NMR分析中被認為是一種穩(wěn)健的方法；此外還有均值標準化、分位數(shù)標準化、中值標準化、z-score標準化等（Li et al.,2017），這些方法也可以結合使用（Di et al.,2016）。不同方法可能會引起不同分析目的的差異，比如進行差異分析的時候，使用分位數(shù)方法可能比PQN方法好，而在進行代謝標志物篩選時，則表現(xiàn)差不多（Li et al.,2017）。因此，在分析的時候也可多嘗試一些標準化的方法。
總的來說，缺失值和標準化的處理方法目前并無完全統(tǒng)一的標準，需要結合具體的實驗方法、目的進行多次的調試以達到所期望的目標。目前，百邁客云上的代謝組分析平臺已包含上述部分處理方法，操作簡單，分析速度快，后續(xù)也會不斷增加更多的處理方式以滿足不同需求。
參考文獻：
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