研究背景

慢性肉芽腫病（Chronic?Granulomatous?Disease,?CGD）是一種由NADPH氧化酶2（NOX2）復(fù)合體功能缺失突變引起的原發(fā)性免疫缺陷病。這種缺陷會導(dǎo)致產(chǎn)生ROS的多種先天免疫細(xì)胞受到損害，機(jī)體抵御微生物的能力下降，導(dǎo)致CGD患者易發(fā)生反復(fù)感染和過度炎癥反應(yīng)。本研究通過構(gòu)建自然CGD小鼠模型，結(jié)合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組（scRNA-seq）和空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)（包括BMKMANU?S1000平臺），深入解析了CGD肺部肉芽腫形成的細(xì)胞與分子機(jī)制，從CGD肺肉芽腫組織中鑒定出具有NOS2高表達(dá)特征的中性粒細(xì)胞和MMP12+巨噬細(xì)胞，并提出MIF和Morbidity為CGD治療的潛在靶點(diǎn)。

研究內(nèi)容及結(jié)果

1、通過接觸清潔環(huán)境（CL）建立CGD肉芽腫模型

通過不同環(huán)境暴露（SPF或CL）實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)研究了環(huán)境病原體對CGD遺傳背景小鼠表型的影響。表現(xiàn)為HE染色全肺葉顯微圖像可見CL環(huán)境下的Ncf2?/?小鼠肺部出現(xiàn)明顯的肉芽腫結(jié)構(gòu)，伴隨炎癥細(xì)胞浸潤和組織壞死，其他組小鼠肺部正常。免疫熒光顯示肉芽腫中的巨噬細(xì)胞（CD68+）表達(dá)上皮標(biāo)志物E-cadherin，提示巨噬細(xì)胞發(fā)生上皮樣轉(zhuǎn)化。通過ELISA法檢測CL?Ncf2?/?小鼠血清中的IL-1β和IFN-γ炎癥相關(guān)蛋白水平較CL?WT組增加。16S?rRNA/ITS?測序顯示CL?Ncf2?/?小鼠肺部細(xì)菌（如克雷伯菌和葡萄球菌）和真菌（如Talaromyces）負(fù)荷顯著增加。

2、單細(xì)胞分辨率下小鼠肺部免疫景觀的分析

通過單細(xì)胞RNA測序和流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)CGD小鼠肺部炎癥微環(huán)境以髓系細(xì)胞浸潤為主，提示其參與肉芽腫形成。其中單細(xì)胞測序，最終保留了25296個高質(zhì)量細(xì)胞樣本，每個細(xì)胞平均包含6466條比對讀數(shù)和1972個基因，并識別出9種免疫細(xì)胞類型及九種基質(zhì)細(xì)胞類型。還發(fā)現(xiàn)一個以細(xì)胞周期相關(guān)基因（Mki67和Top2a）高表達(dá)為特征的細(xì)胞簇。通過流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，CL?Ncf2?/?小鼠中CD11b高表達(dá)的F4/80+MDMs在比例和絕對數(shù)量上均顯著增加，這些結(jié)果揭示了慢性肉芽腫性葡萄膜炎（CGD）小鼠在肺部感染過程中免疫細(xì)胞組成的顯著變化，尤其是中性粒細(xì)胞和MDMs的明顯聚集現(xiàn)象。

3、CGD小鼠中性粒細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄改變

研究顯示，中性粒細(xì)胞分為6個亞群，其中Neu6亞群在CL?Ncf2?/?小鼠中顯著擴(kuò)增且Neu6高表達(dá)促炎基因（如Nos2、Mif、Tnf、Il1b）。NO是一種在病原體清除過程中起關(guān)鍵作用由NOS2合成的可擴(kuò)散小分子，CL?Ncf2?/?小鼠肺部的總NO生成量顯著升高。流式驗(yàn)證顯示CL?Ncf2?/?小鼠肺中NOS2high中性粒細(xì)胞比例顯著增加。這些結(jié)果均提示NOS2high中性粒細(xì)胞通過產(chǎn)生一氧化氮（NO）和促炎因子，驅(qū)動肉芽腫核心區(qū)的炎癥反應(yīng)。

4、CGD小鼠單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞區(qū)室的轉(zhuǎn)錄改變

通過對巨噬細(xì)胞亞群進(jìn)行聚類分析和功能富集，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞分為5個亞群，Mac1亞群在CL?Ncf2?/?小鼠中顯著增加。Mac1同時(shí)表達(dá)M1（Nos2）和M2（Arg1）標(biāo)志物，以及促纖維化基因（如Mmp12、Spp1）。免疫熒光顯示MMP12+巨噬細(xì)胞特異性分布于肉芽腫外圍。以上結(jié)果提示MMP12+巨噬細(xì)胞具有混合表型，可能通過細(xì)胞外基質(zhì)重塑促進(jìn)肉芽腫的纖維化包裹。

5、空間轉(zhuǎn)錄組揭示肉芽腫結(jié)構(gòu)

使用SeekSpace和BMKMANU?S1000平臺分析肺組織切片的空間轉(zhuǎn)錄組。研究表明肉芽腫核心區(qū)富集中性粒細(xì)胞（Neu6亞群），外圍富集巨噬細(xì)胞（Mac1亞群）和成纖維細(xì)胞。Mac1高表達(dá)促炎（Nos2）和促纖維化（Mmp12、Fn1）基因。成纖維細(xì)胞高表達(dá)膠原基因（Col1a1、Col4a1），提示其參與纖維化。

以上結(jié)果提示通過BMKMANU?S1000平臺進(jìn)行的空間轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)Neu6占據(jù)肉芽腫中心區(qū)域，而Mac1和成纖維細(xì)胞在外圍區(qū)域參與細(xì)胞外基質(zhì)重塑和纖維化包被過程。明確了肉芽腫中不同細(xì)胞的分布和功能分工，揭示了炎癥與纖維化的協(xié)同作用。

6、干預(yù)策略的效果驗(yàn)證

通過對巨噬細(xì)胞亞群進(jìn)行聚類分析和功能富集，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞分為5個亞群，Mac1亞群在CL?Ncf2?/?小鼠中顯著增加。Mac1同時(shí)表達(dá)M1（Nos2）和M2（Arg1）標(biāo)志物，以及促纖維化基因（如Mmp12、Spp1）。免疫熒光顯示MMP12+巨噬細(xì)胞特異性分布于肉芽腫外圍。以上結(jié)果提示MMP12+巨噬細(xì)胞具有混合表型，可能通過細(xì)胞外基質(zhì)重塑促進(jìn)肉芽腫的纖維化包裹。

研究總結(jié)

首次通過環(huán)境暴露構(gòu)建自然CGD模型，結(jié)合多組學(xué)技術(shù)解析肉芽腫的細(xì)胞和分子機(jī)制。本研究揭示了CGD肉芽腫中NOS2high中性粒細(xì)胞和MMP12+巨噬細(xì)胞的協(xié)同作用，并提出MIF和Morrbid作為潛在治療靶點(diǎn)，為CGD的精準(zhǔn)干預(yù)提供了理論基礎(chǔ)。BMKMANU?S1000空間轉(zhuǎn)錄組通過高分辨率空間定位明確揭示了中性粒細(xì)胞（Neu6亞群）在肉芽腫核心、巨噬細(xì)胞（Mac1亞群）和成纖維細(xì)胞在外圍的分布。在基因表達(dá)驗(yàn)證時(shí)確認(rèn)了NOS2、MIF、IL-1β等基因在肉芽腫不同區(qū)域的差異表達(dá)，這一結(jié)果與scRNA-seq結(jié)果高度一致，展示了BMKMANU?S1000在疾病微環(huán)境研究中的高效性。

中文題目：5-ASA的腸道微生物代謝降低了其在炎癥性腸病中的臨床療效

發(fā)表期刊：nature medicine

發(fā)表時(shí)間：2023

影響因子：82.9

研究背景

炎性腸病 (IBD)是一種慢性、使人虛弱的胃腸疾病，治療失敗率較高。目前尚無系統(tǒng)的方法預(yù)測對IBD療法的反應(yīng)?？寡姿幬锩郎忱?，也被稱為5-氨基水楊酸 (5-ASA)，是IBD最常用的處方療法之一，通常在結(jié)腸內(nèi)發(fā)揮作用；然而，隨著時(shí)間的推移，超過一半的IBD患者對5-ASA沒有反應(yīng)或最終失去反應(yīng)。因此，有必要確定并消除此類治療失敗的原因。

研究思路

研究重點(diǎn)

1、來自IBD患者的多組學(xué)研究確定了5-ASA的使用

利用人類微生物組項(xiàng)目炎癥性腸病多組學(xué)數(shù)據(jù)庫（IBDMDB，http://ibdmdb.org），對79名克羅恩病（CD）或潰瘍性結(jié)腸炎（UC）患者的糞便樣本進(jìn)行多組學(xué)分析，共鑒定了1036個宏基因組（MGX）、440個元轉(zhuǎn)錄本（MTX）和508個非靶向代謝組（MBX），以及283個MBX-MGX對和213個MGX-MTX對。隨后針對13名新使用5-ASA的患者來確定5-ASA在體內(nèi)直接調(diào)節(jié)的特定糞便代謝物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5-ASA使用前后中的5-ASA和N-乙酰5-ASA水平呈顯著差異，且經(jīng)5-ASA治療后，賴氨酸合成途徑中的細(xì)菌代謝產(chǎn)物—2-氨基己二酸的含量減少，煙酸代謝也發(fā)生了顯著變化。

進(jìn)一步評估微生物、宿主和其他因素對這些差異顯著的代謝物的相對貢獻(xiàn)，最終發(fā)現(xiàn)5-ASA的藥物水平在確定5-ASA調(diào)節(jié)代謝物水平方面具有最大的預(yù)測能力（35%），其次是微生物組特征（15%）和其他宿主因素（7%）。隨后，通過另一個獨(dú)立的IBD患者隊(duì)列中鑒定并驗(yàn)證了兩種可能的5-ASA衍生物—N-丙?；?-ASA和N-丁?；?-ASA，它們的變化可以部分地由腸道微生物組來解釋。

圖1?5-ASA可直接影響糞便代謝組，并通過微生物組進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化

2、5-ASA代謝腸道微生物酶的鑒定

接下來確定參與5-ASA生物轉(zhuǎn)化的腸道微生物酶。首先對服用及未服用5-ASA的患者微生物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，最終鑒定了兩個顯著過表達(dá)的具有推定乙酰轉(zhuǎn)移酶功能的UniRef90基因簇：GNAT家族NAT（UniRef90 ID: C7H1G6）和乙酰輔酶a乙酰轉(zhuǎn)移酶（UniRef90 ID: R6TIX3），以及四個具有乙酰輔酶a乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域的候選基因（IDs: R6CZ24, R5CY66, T5S060和A0A1C6JPG6）。隨后將糞便樣本分為N-乙酰5-ASA高水平和N-乙酰5-ASA低/陰性水平兩組，計(jì)算與N-乙酰5-ASA相關(guān)的每個元轉(zhuǎn)錄組基因簇的敏感性和特異性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了另外7個假定的乙酰轉(zhuǎn)移酶基因簇與使用者的N-乙酰5-ASA水平呈正相關(guān)。最終得到的12個之前未被表征的候選乙酰轉(zhuǎn)移酶可分為硫解酶和?；o酶A N-?；D(zhuǎn)移酶兩組，其中?；o酶A NAT家族比硫解酶家族表現(xiàn)出更大的序列異質(zhì)性，且?；o酶A NAT酶幾乎都來自擬桿菌門，而硫解酶來自厚壁菌門。通過研究菌株水平的基因組，同樣發(fā)現(xiàn)了一部分普氏鐮孢菌株編碼相關(guān)的乙酰轉(zhuǎn)移酶。

圖2N-乙酰5-ASA微生物酶包括硫代酶和?；o酶A N-乙酰轉(zhuǎn)移酶

3、5-ASA失活酶生化特性的推定

為了推測硫解酶和酰基輔酶A NAT超家族具有潛在的5-ASA滅活能力，選用來自厚壁菌門的候選硫解酶CAG:176（UniRef90 ID: R6CZ24）和來自福氏假單胞菌的?；o酶A NAT（UniRef90 ID:C7H1G6）用于進(jìn)一步的生化表征。用已知的腸道鏈球菌酶作為陽性對照，對乙酰化5-ASA采用體外質(zhì)譜分析，最終證實(shí)了厚壁菌CAG:176硫解酶和F. prausnitzii?；o酶A NAT具有使用乙酰輔酶A乙?；?-ASA的能力。

隨后測試了硫解酶對其他含胺基異生素（包括5-ASA異構(gòu)體4-ASA、異煙肼、普魯卡因胺和肼屈嗪）的乙?；钚?，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)這些化合物的任何乙?；@表明了硫解酶的底物選擇性。此外，編碼第二個預(yù)測的硫解酶基因（R6TIX3）的Oscillibacter sp菌株KLE 1745的活培養(yǎng)物也能夠?qū)?-ASA乙?；癁镹-乙?；?-ASA。

為了深入了解厚壁菌CAG:176硫解酶（FcTHL）如何乙?；?-ASA，將FcTHL的乙?；磁潴w晶體結(jié)構(gòu)疊加在乙?；蚪饷妇w結(jié)構(gòu)上，與來自充分表征的革蘭氏陰性分枝菌（ZrTHL）的乙酰輔酶A復(fù)合。隨后將FcTHL與NAT (PDB ID: 2PFR)的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對，進(jìn)一步探究厚壁菌CAG:176硫解酶的推定活性位點(diǎn)是否類似于腸道鏈球菌NAT的活性位點(diǎn)，最終揭示了活性位點(diǎn)區(qū)域中的半胱氨酸和組氨酸三聯(lián)體。

圖3?5-ASA在體外的乙?；钚缘淖C實(shí)

4、IBD治療失敗與5-ASA代謝酶的宏基因組攜帶有關(guān)

基于臨床服用5-ASA的個體差異性，接下來檢查12種乙酰轉(zhuǎn)移酶的存在是否與5-ASA治療失敗有關(guān)。收集39名在任何時(shí)間點(diǎn)接受5-ASA治療及使用類固醇患者的609份糞便樣本，使用多變量邏輯回歸模型，調(diào)整與疾病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)了因素-年齡、性別、吸煙狀況和IBD亞型，納入每個參與者的NAT2表型來解釋宿主遺傳，最終發(fā)現(xiàn)糞便樣本中存在4種乙酰轉(zhuǎn)移酶基因與類固醇起始風(fēng)險(xiǎn)增加顯著相關(guān)。4種乙酰轉(zhuǎn)移酶基因有三種來自硫解酶超家族，一種來自酰基輔酶A超家族。且較早的發(fā)病年齡和CD與UC狀態(tài)相比，同樣與開始使用類固醇的更高風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。但未發(fā)現(xiàn)類固醇使用風(fēng)險(xiǎn)和大腸桿菌NAT的宏基因組存在聯(lián)系。

在敏感性分析中，微生物乙酰轉(zhuǎn)移酶基因數(shù)量的增加與類固醇起始風(fēng)險(xiǎn)的增加顯著相關(guān)；從未使用過5-ASA治療的患者基因家族與類固醇的使用沒有正相關(guān)。隨后使用混合效應(yīng)模型對參與者進(jìn)行調(diào)整，發(fā)現(xiàn)存在三個或更多乙酰轉(zhuǎn)移酶基因也與類固醇使用風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)，這在隨后在未使用類固醇的208名5-ASA使用者隊(duì)列中得到了驗(yàn)證。

圖4腸道微生物5-ASA滅活乙酰轉(zhuǎn)移酶與5-ASA使用者治療失敗的更大風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)

研究總結(jié)

本研究結(jié)果首次提供了特異性腸道代謝酶與IBD 5-ASA治療失敗之間的直接聯(lián)系，從而產(chǎn)生了直接的臨床潛力。5-ASA是UC最常用的處方藥。為了保持有效，它必須以未修飾的形式存在于結(jié)腸腔中，因此，與其他藥物不同，它在小腸中的吸收很差。5-ASA治療失敗的個體通常進(jìn)展為風(fēng)險(xiǎn)更高的免疫抑制治療，而只有在必要時(shí) (即腸道微生物組中存在修飾5-ASA的硫解酶序列)才有能力這樣做，這將為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)提供有價(jià)值的生物標(biāo)志物。此外，闡明微生物失活5-ASA的酶學(xué)機(jī)制可能有助于未來研發(fā)微生物特異性酶抑制劑，以增強(qiáng)5-ASA的療效。在本研究中，我們的數(shù)據(jù)是觀察性的；需要更多的介入研究來加強(qiáng)我們的發(fā)現(xiàn)，無論是通過在IBD患者中的臨床試驗(yàn)還是通過單定植小鼠。目前，這些發(fā)現(xiàn)為IBD的個性化微生物醫(yī)學(xué)打開了一扇概念之窗。

1、前言

1.1適用范圍

本指南介紹百邁客動物類組織&核酸樣品的送樣要求及制備方法。采集送樣前請?jiān)敿?xì)閱讀。信息單中樣本名稱、組織部位必須與實(shí)物相符，避免因信息單與實(shí)物不符導(dǎo)致反復(fù)核對，影響樣本質(zhì)量、錄入周期，導(dǎo)致提取核酸質(zhì)量不滿足建庫測序要求，實(shí)驗(yàn)周期過長等

1.2提取風(fēng)險(xiǎn)提示

核酸提取質(zhì)量與物種及組織部位、樣本制備、樣本交接、提取方法與操作、以及環(huán)境等因素息息相關(guān)，尤其是三代超長提取對樣的要求更高。組織提取時(shí)可能受到上下游處理操作的影響，因此較難保證單次提取滿足質(zhì)量要求，望老師知悉理解，并做好組織備份。為保障獲得相對較高質(zhì)量的核酸，請老師務(wù)必按照以下指導(dǎo)原則準(zhǔn)備樣本。對于珍貴樣本或微量樣本，建議自行提取

2、組織送樣量要求

注1：未在表格出現(xiàn)的物種，請單獨(dú)溝通。送樣量結(jié)果展示為滿足提取一次的量，如樣品經(jīng)過特殊處理或樣本狀態(tài)異常有幾率影響得率，為了保證您的實(shí)驗(yàn)可以順利進(jìn)行，請酌情增加送樣量

注2：由于骨骼含有大量鈣鹽和礦物質(zhì)，細(xì)胞密度低，核酸含量較少；毛發(fā)暴露在外界環(huán)境，容易受到紫外線、溫度變化、微生物影響，導(dǎo)致核酸降解，毛干核酸含量低，毛囊周圍細(xì)胞多難獲取，為了保證您實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行，這兩個部位不建議送組織樣，建議自行提取

3、核酸送樣要求

1)核酸送樣需要提供相關(guān)檢測結(jié)果，DNA類核酸可提供以下檢測手段中的一種或多種檢測結(jié)果： Qubit、 NanoDrop、 AGE，同時(shí)請采取適當(dāng)?shù)募兓椒?，以避免多糖、多酚、蛋白或者核酸酶對DNA樣品的污染，并詳細(xì)注明溶解DNA所使用的溶解液類型

2)如果您開展的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目為miRNA的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，并且提供的是總RNA的樣本，請務(wù)必確認(rèn)您采用的總RNA的提取方法保留了小RNA （ 包括miRNA），提取試劑盒型號備注送樣信息單中

3.1二代DNA送樣量要求

3.2三代DNA送樣量要求

3.3RNA類送樣量要求

1)針對核酸有雜質(zhì)、污染、粘稠、顏色等情況，需要過柱純化后送樣或者酌情增加送樣量

2)核酸樣品建議使用1.5ml、2ml EP管裝載樣品，其他保存管容易破裂且不利于保存樣品和后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展

3)為了防止樣品污染和混淆，禁止使用96孔板和深孔板裝載樣品

4)用乙醇沉淀的樣品由于運(yùn)輸中會有少量乙醇揮發(fā)，建議將樣品管蓋用封口膜纏繞4-5圈

5)考慮到核酸可能存在含有雜質(zhì)、顏色等物質(zhì)導(dǎo)致會產(chǎn)生大量損失的風(fēng)險(xiǎn)，為保證樣本一次檢測合格并節(jié)約寶貴的重送樣時(shí)間，送樣建議量是高于公司判定標(biāo)準(zhǔn)的，請?jiān)诤怂崃孔銐虻那疤嵯卤M量按照送樣建議來送樣。

4、樣品制備保存指南

4.1常規(guī)動物類樣本

送樣需要選擇新鮮采集的樣本，尤其是Ultra long ONT建庫，樣本的取材優(yōu)先選擇核酸含量相對較高的組織，樣本制備優(yōu)先級：血液>內(nèi)臟>肌肉?；铙w取下新鮮組織（肌肉、肝臟或其他組織，避免用易于寄生微生物的表皮和腸道、可能有變異細(xì)胞的病變組織），立即剔除結(jié)締組織和脂肪組織等非研究所需的組織類型。對腫瘤組織的取材，應(yīng)盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤和正常組織，腫瘤組織應(yīng)將周圍的正常組織切除干凈（正常組織也應(yīng)將周圍的腫瘤組織切除干凈），腸道組織一定要把內(nèi)容物清洗干凈

4.1.1液氮速凍組織操作流程（所有產(chǎn)品適用）

1)提前準(zhǔn)備好冷凍組織的足量液氮，預(yù)裝樣品的凍存管，并在做好標(biāo)記（盡量不使用漢字命名，命名字符控制在5個以內(nèi)）

2)活體取下新鮮的組織

3)迅速用預(yù)冷的PBS溶液（RNase free）或0.9%生理鹽水將組織表面的殘留血液沖洗干凈

4)如果組織體積較大，將組織切成長寬高均≤0.5 mm 的小塊（即黃豆大?。?/p>

5)將凍處理好的組織樣本混合均勻后保存于2 mL 或更大體積的螺口凍存管（RNase free）中，標(biāo)注編號

6)立即（20s內(nèi)）置于液氮中冷凍 3~4 h，然后轉(zhuǎn)移至-80 °C長期保存

7)干冰運(yùn)輸

4.1.2TRIzol保存樣品制備流程（僅RNA細(xì)胞和研磨后的組織適用）

1)如果使用 TRIzol裂解液保存送樣，請務(wù)必先進(jìn)行液氮研磨破碎，樣品量取參考標(biāo)準(zhǔn)送樣量的1/3，然后溶于 TRIzol 中，組織樣品切勿過量

2)震蕩混勻，常溫裂解 5 min 后，使用低溫離心機(jī)12000g離心10min，將上清液轉(zhuǎn)至新的2.0ml離心管中（拍質(zhì)控照片，方便核查），轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，運(yùn)輸時(shí)選擇干冰寄送

3)禁止使用trizol保存組織樣品送樣

4.1.3RNAlater? Tissue Collection保存樣品制備流程（僅RNA適用）

1)用RNAlater? Solution保存組織之前，需要將組織切割成長寬高均≤ 0.5 mm的小塊

2)如果組織帶血液或其他體液，需要過夜后更換一次RNAlater? Solution；不要將剛浸入RNAlater Solution中的樣本立即冷凍，需將樣本置于4 °C 保存過夜（使Solution充分浸潤組織樣本），然后轉(zhuǎn)移至-20 °C 或-80 °C 長期保存

3)RNAlater? Solution 不會影響組織結(jié)構(gòu)，可以把已保存的組織從 RNAlater? Solution中取出，切下實(shí)驗(yàn)所需的用量，把剩余的組織再放入到原來的保存液中繼續(xù)保存

4)保存于RNAlater? Solution中樣本，-20 °C 存放時(shí)，樣本不會結(jié)凍，但可能會有晶體析出，這并不影響后續(xù)的 RNA 提取工作；-80 °C 存放時(shí)，樣本會結(jié)凍， 在進(jìn)行 RNA 提取前，需置于冰上融化再進(jìn)行后續(xù)操作，解凍后的樣本可再次放入-80 °C 保存

5)一般來講，生物樣本保存于RNAlater? Solution中，37 °C可存放1天，25 °C（室溫）可存放1周，4 °C 可存放1個月，-20 °C 或-80 °C 可長期保存。但鑒于生物樣本的特殊性及實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性，建議所有保存于RNAlater? Solution中樣本，都要置于-20 °C 或-80 °C 長期保存

注：如果組織較小，建議優(yōu)先選擇此方式送樣

4.2全血

DNA類產(chǎn)品推薦使用EDTA抗凝管采集后分裝，RNA類產(chǎn)品優(yōu)先推薦使用PAXgene血液RNA管采集。血樣建議為新鮮采集，不建議保存時(shí)間過長。血液相關(guān)產(chǎn)品僅接收全血或分離的細(xì)胞樣本，不接收血清、血漿。

4.2.1DNA常規(guī)產(chǎn)品制備操作流程

1)用醫(yī)用抗凝管或已裝有抗凝劑（選用檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝劑，由于會影響實(shí)驗(yàn)所以不可用肝素）的旋蓋管收集全血樣本

2)上下輕輕顛倒混勻十次后，分裝到常規(guī)EP管中（體積不要超過EP管的一半），轉(zhuǎn)移至-20或-80 °C長期保存（實(shí)際根據(jù)采血管的說明要求操作）

3)干冰運(yùn)輸

注1：血液采集管請盡量不要用需專門對應(yīng)提取試劑盒的采血管，以防送樣后我們因無對應(yīng)試劑盒影響提取時(shí)間（盡量送樣前溝通）

注2：采集完血液之后需將血液轉(zhuǎn)移至EP管中，玻璃材質(zhì)采血管冷凍之后易碎

4.2.2Ultra Long ONT樣本制備流程

4.2.2.1新鮮血液

1)采集血液（ 5- 10mL），然后加入含 EDTA 抗凝管中（不可使用肝素 、檸檬酸鈉等抗凝管，建議使用 Cell-Free 采血管，做好標(biāo)記（樣本名稱，日期，體積）

2)輕輕顛倒混勻十次，室溫正立放置

3)冰袋（4 °C ）運(yùn)輸需避開節(jié)假日（注意冰袋盡可能多放，樣本置于中間，保證箱體溫度維持在 4 °C）。從血液離體算起，運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)人員手中不可超過 3 天

4.2.2.2凍存血液

1)血液用抗凝管采集后輕輕顛倒混勻十次

2)哺乳動物血液分裝到 2ml 離心管里，1ml/管（至少2管，若血量不足，可根據(jù)實(shí)際情況送樣）

3)魚類、禽類、兩棲類全血分裝到 1.5ml 離心管里， 100ul/管（至少5管,若血量不足，可根據(jù)實(shí)際情況送樣）

4)做好標(biāo)記（樣本名稱， 日期，體積），液氮速凍，干冰寄送

4.2.3RNA產(chǎn)品制備操作流程

4.2.3.1PAXgene血液RNA管制備流程（人和靈長類動物優(yōu)先選擇該方式送樣）

1)PAXgene管的介紹

在研究細(xì)胞內(nèi) RNA 使用的許多分子測試中，采集全血是第一步。 這類測試中的最大挑戰(zhàn)是細(xì)胞內(nèi) RNA不穩(wěn)定，在采血后幾小時(shí)內(nèi)迅速降解。 此外，通過基因誘導(dǎo)過程，某些種類的 RNA 采血后在體外增加。 體外 RNA 降解和基因誘導(dǎo)均會導(dǎo)致體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄物相對數(shù)量估計(jì)過低或過高。 PAXgene 血液RNA 管含有一種附加劑，通過減少體外 RNA 降解和盡量減少基因誘導(dǎo)，可穩(wěn)定體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄譜。 與PAXgene 血液 RNA 套件配套使用時(shí)，PAXgene 血液 RNA 管可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的基因轉(zhuǎn)錄物檢測和定量

2)采集前準(zhǔn)備

A.PAXgene Blood RNA Tube（2.5mL采血管，含專用RNA穩(wěn)定劑）

B.符合標(biāo)準(zhǔn)的靜脈采血裝置（無菌針頭、持針器、止血帶等）

C.毒用品（酒精棉片、碘伏等）

D.生物安全防護(hù)裝備（手套、護(hù)目鏡等）

3)采集流程

A.確保 PAXgene 血液 RNA 管使用前在 18-25?C 溫度下，且正確貼有標(biāo)本識別標(biāo)簽

B.如果 PAXgene 血液 RNA 管是待抽吸的唯一試管，應(yīng)當(dāng)先抽血至“丟棄管”，再抽血至 PAXgene 血液 RNA 管，這樣便可以灌注放血過程中使用的采血裝置的內(nèi)部空間。 否則，PAXgene 血液 RNA 管應(yīng)是放血程序中最后抽吸的試管

C.采用您所在機(jī)構(gòu)推薦的標(biāo)準(zhǔn)靜脈穿刺技術(shù)程序，使用采血裝置和試管固定器，采血2.5ml至 PAXgene 血液RNA 管

D.采血后立即輕輕地將PAXgene 血液 RNA 管倒置 8–10 次

E.在室溫下 (18–25?C) 直立存儲 PAXgene 血液 RNA 管至少 2 小時(shí)，最多 72 小時(shí)，然后再處理或轉(zhuǎn)移至冷藏室 (2–8?C) 或冷凍室 (-20?C)。 若需要 -70?C / -80?C 的存儲溫度，請參見“PAXgene 血液RNA 管內(nèi)所采集標(biāo)本的冷凍和解凍程序” 以獲取詳細(xì)信息

4)注意事項(xiàng)

A.確保采血管在有效期內(nèi)，無漏液或變色（正常試劑為淡黃色）

B.不可預(yù)先打開管蓋，避免穩(wěn)定劑失效

C.一旦受到碰撞，冷凍的 PAXgene 血液 RNA 管就容易破裂。為降低在運(yùn)輸期間破裂的風(fēng)險(xiǎn)，請按照處理玻璃管的方式來處理冷凍的試管。使用者必須確認(rèn)自己的 PAXgene 血液 RNA 管冷凍和運(yùn)輸協(xié)議

D.PAXgene 血液 RNA 管填充不足會導(dǎo)致血液與附加劑的比率錯誤，且可能導(dǎo)致分析結(jié)果錯誤或產(chǎn)品性能欠佳

E.PAXgene血液 RNA 系統(tǒng)不適用于采集和純化病毒 RNA

4.2.3.2EDTA抗凝管送樣制備流程

1)用醫(yī)用抗凝管或已裝有抗凝劑（選用檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝劑，由于會影響實(shí)驗(yàn)所以不可用肝素）的旋蓋管收集全血樣本

2)上下輕輕顛倒混勻十次后，分裝到常規(guī)EP管中（體積不要超過EP管的一半），轉(zhuǎn)移至-20或-80 °C長期保存（實(shí)際根據(jù)采血管的說明要求操作）

3)干冰運(yùn)輸

4.3細(xì)胞

4.3.1貼壁細(xì)胞

4.3.1.1液氮速凍法

1)確定細(xì)胞生長狀態(tài)良好；離心得到細(xì)胞沉淀（依據(jù)客戶實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過實(shí)而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速800g為宜）

2)棄去培養(yǎng)基，加入 1 mlLPBS（RNase free，室溫），輕輕將細(xì)胞沉淀懸起， 轉(zhuǎn)移至 2 mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中

3)離心（依據(jù)客戶實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過實(shí)而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速800g為宜）得到細(xì)胞沉淀，棄去PBS，液氮速凍2h之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送

4.3.1.2TRIzol裂解法

1)離心收集的細(xì)胞迅速溶于 TRIzol 裂解，每 5 X 10^6個細(xì)胞加 1 mL TRIzol

2)細(xì)胞溶于 TRIzol 后，如出現(xiàn)成團(tuán)，需用吸頭將細(xì)胞團(tuán)吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細(xì)胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解

3)室溫靜置5min，之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送

注：判斷裂解液加入量是否合適的標(biāo)準(zhǔn)可以根據(jù)細(xì)胞溶解物的黏度來判斷。在細(xì)胞剛?cè)芙鈺r(shí)，可以發(fā)現(xiàn)有絲狀物出現(xiàn)，若裂解液加入量合適，吹打幾次后，絲狀物會消失，液體黏稠性下降；若裂解液的量過少，絲狀物往往一直存在，液體黏稠性大，應(yīng)繼續(xù)補(bǔ)加裂解液。裂解液加入量過少，會導(dǎo)致抽提的 RNA 降解

4.3.2懸浮細(xì)胞

4.3.2.1液氮速凍法

1)確定細(xì)胞生長狀態(tài)良好；離心得到細(xì)胞沉淀（依據(jù)客戶實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過實(shí)而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速800g為宜）

2)棄去培養(yǎng)基，加入 1 mlLPBS（RNase free，室溫），輕輕將細(xì)胞沉淀懸起， 轉(zhuǎn)移至 2 mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中

3)離心（依據(jù)客戶實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過實(shí)而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速800g為宜）得到細(xì)胞沉淀，棄去PBS，液氮速凍2h之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送

4.3.2.2TRIzol裂解法

1)離心收集的細(xì)胞迅速溶于 TRIzol 裂解，每 5 X 10^6個細(xì)胞加 1 mL TRIzol

2)細(xì)胞溶于 TRIzol 后，如出現(xiàn)成團(tuán)，需用吸頭將細(xì)胞團(tuán)吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細(xì)胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解

3)室溫靜置5min，之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送

5、注意事項(xiàng)

核酸提取質(zhì)量與物種及組織部位、采集方法及保存狀態(tài)、提取方法及操作、實(shí)驗(yàn)器材及環(huán)境等因素均有密不可分的聯(lián)系，尤其是三代超長提取對樣本的質(zhì)量、總量要求更高，望知悉及理解，并做好樣本備份。為了保障獲得高質(zhì)量的核酸，請務(wù)必按照送樣手冊所規(guī)定的準(zhǔn)備樣本。對珍貴樣本或者微量樣本，建議自行提取

1)組織速凍時(shí)間：組織離體后，胞內(nèi)核酸便開始降解，尤其是 RNA，故采集時(shí)，目的組織離體后，需立即速凍，建議 3min 內(nèi)完成，越快越好。速凍時(shí)間過短會導(dǎo)致速凍不徹底，核酸有降解風(fēng)險(xiǎn)

2)組織送樣量：建議送樣量適用于 95%的物種組織，少部分組織因胞內(nèi)核酸量較低，需適當(dāng)增加送樣量，比如動物皮膚、毛發(fā)等。請嚴(yán)格按照上方組織送樣量要求送樣，送樣量過少或過多均不利于提取實(shí)驗(yàn)。采樣量較少會導(dǎo)致提取的核酸總量、濃度不合格，采樣量過多反而會造成速凍不徹底、提取取樣困難、凍融降解等危險(xiǎn)

3)組織狀態(tài)：不建議送組織狀態(tài)差或非生長旺盛期樣品，核酸有一定幾率降解

4)組織保存管的選擇：所有組織樣品務(wù)必使用離心管或螺紋管保存，切勿直接裝入密封袋（低溫凍脆易破裂，導(dǎo)致樣品泄露，交叉污染）保存

5)組織樣品保存方法選擇：首選液氮速凍；沒有液氮條件的，可直接放入-80℃冰箱凍存。未使用液氮速凍或液氮速凍時(shí)間過短都有一定幾率導(dǎo)致核酸降解

6)組織送樣方式的選擇：干冰運(yùn)輸，且需要保證干冰的充足，冰袋和常溫送樣，有幾率導(dǎo)致核酸的降解。除RNA類樣品可使用RNAlater保存送樣，其余產(chǎn)品均建議送速凍組織，不建議使用保護(hù)液送樣，化開離心會有幾率導(dǎo)致核酸降解；不建議酒精送樣，固定不徹底，有一定幾率殘留核酸酶，降解核酸

7)凍融組織： 組織凍存后，一旦凍融，核酸降解概率大于 80%，幾乎不可能提取成功，此類組織不建議送樣。請各位老師送樣前注意組織保存狀態(tài)， 確保組織未發(fā)生過凍融情況

8)帶血組織：由于血液沒有專業(yè)的保護(hù)劑，去除不凈一起速凍送樣會影響組織的完整性

9)長年保存的組織：保存時(shí)間超過一年的組織不建議送樣

10)組織分離要求：正常組織樣本中不能含有病變組織，而病變組織樣本中也不可以夾帶有正常組織，提取實(shí)驗(yàn)時(shí)無法精確取樣，無法稱重。組織量過多的不能全部取樣，只隨機(jī)選取適量組織提取

11)對于同一個組織樣品需要同時(shí)提取 DNA和 RNA 的，請務(wù)必分成兩管分批次送樣。樣本的特殊處理包括：鹽處理、溫度處理、藥物處理、病毒侵染、傷害處理、干旱處理等脅迫處理方式，不同程度的處理對樣本的核酸質(zhì)量會造成不同程度的影響，常見的會導(dǎo)致核酸 的降解或者得率降低。因此，經(jīng)過特殊處理的樣本，在送樣時(shí)，務(wù)必請?jiān)跇颖拘畔沃羞M(jìn)行詳細(xì)的備注，以便盡量提高提取的成功率和避免樣本的浪費(fèi)

6、不合格樣品存在風(fēng)險(xiǎn)

6.1樣本總量不足、濃度過低存在風(fēng)險(xiǎn)

1)文庫構(gòu)建失敗

2)文庫產(chǎn)量低不能上機(jī)測序或測序數(shù)據(jù)量不足

3)導(dǎo)致數(shù)據(jù)隨機(jī)性異常

4)數(shù)據(jù)質(zhì)量差

6.2降解樣本風(fēng)險(xiǎn)

1)文庫構(gòu)建失敗

2)文庫產(chǎn)量低不能上機(jī)測序或測序數(shù)據(jù)量不足

3)導(dǎo)致數(shù)據(jù)隨機(jī)性異常

4)數(shù)據(jù)質(zhì)量差

5)導(dǎo)致數(shù)據(jù)duplication比例高、隨機(jī)性差

6)導(dǎo)致Small RNA rRNA比例高，影響有效數(shù)據(jù)，文庫片段異常

6.3蛋白或其他雜質(zhì)污染

1)可能影響Small RNA電泳分離，造成切膠不準(zhǔn)，影響問題質(zhì)量

2)可能影響RNA-seq磁珠分離導(dǎo)致建庫失敗，或即使達(dá)到上機(jī)要求也可能導(dǎo)致文庫隨機(jī)性差等問題

3)文庫構(gòu)建失敗

4)文庫產(chǎn)量低不能上機(jī)測序或測序數(shù)據(jù)量不足

6.4目標(biāo)RNA含量低

1)總RNA達(dá)到要求，但由于樣本特異性，small RNA含量低于正常樣本，導(dǎo)致建庫失敗

2)總RNA達(dá)到要求，但由于處理或組織部位的特異性，mRNA降解或含量低，導(dǎo)致建庫失敗或者測序數(shù)據(jù)中rRNA 數(shù)據(jù)比例高

文章標(biāo)題：Spatial and single-cell transcriptomics reveal cellular heterogeneity and a novel cancer-promoting Treg cell subset in human clear-cell renal cell carcinoma

期刊名稱：Journal for ImmunoTherapy of Cancer

影響因子：10.3

合作單位：空軍軍醫(yī)大學(xué)（第四軍醫(yī)大學(xué)）

研究方法：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，空間轉(zhuǎn)錄組測序，流式分選，RT-qPCR，Western blot，免疫組化，多重免疫組化，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

百邁客生物為該研究提供了百創(chuàng)DG1000單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)以及百創(chuàng)S1000空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)服務(wù)，文中百創(chuàng)S1000空間數(shù)據(jù)分析得到的細(xì)胞空間分布圖由百創(chuàng)開發(fā)軟件BSTCellViewer展示。

研究背景

透明腎細(xì)胞癌ccRCC是腎細(xì)胞癌RCC的常見亞型，是腎癌相關(guān)死亡的主要原因，治療手段包括腎切除手術(shù)、靶向治療和免疫治療，但多數(shù)患者不能從免疫治療獲益，這與腫瘤微環(huán)境異質(zhì)性有關(guān)，因此有必要深入理解ccRCC的腫瘤微環(huán)境，助力開發(fā)新型個性化診療方案。

材料及方法

研究材料：15名腎切除術(shù)的ccRCC患者組織樣本及其血液PBMC。對組織樣本區(qū)域進(jìn)行定義，分為腫瘤核心（TC），腫瘤-健康交界（IF，包括腫瘤邊緣TR和臨近健康腎組織AN），遠(yuǎn)端健康腎組織DN。

組別設(shè)計(jì)：實(shí)驗(yàn)組4名ccRCC患者樣本進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序&空間轉(zhuǎn)錄組測序，驗(yàn)證組15名ccRCC患者樣本進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)&多重免疫熒光染色，151名ccRCC患者組織樣本&40名其他腎癌亞型患者組織樣本&6名捐獻(xiàn)者健康腎組織進(jìn)行多重?zé)晒饷庖呓M化染色。

研究方法：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（4名患者不同區(qū)域腫瘤組織，按照CD45+細(xì)胞:CD45-細(xì)胞=9:1增加免疫細(xì)胞數(shù)據(jù)占比，n=12），空間轉(zhuǎn)錄組測序（n=4）；流式分選，RT-qPCR，Western blot，免疫組化，多重免疫組化，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

研究結(jié)果

1.ccRCC組織細(xì)胞類型全面分析

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)顯示不同患者腫瘤組織的免疫微環(huán)境細(xì)胞組成相似，T細(xì)胞占比最高，特別是CD4+ T細(xì)胞。腫瘤區(qū)域（TC/TR）富集CD3+細(xì)胞以及CD8+ T細(xì)胞，而CD4+ T細(xì)胞基本分布在所有區(qū)域。此外，基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞豐度和分布存在差異，TR區(qū)域成纖維細(xì)胞比例顯著低于TC區(qū)域和AN區(qū)域，這一發(fā)現(xiàn)也在空間轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)中得到印證。

圖1-ccRCC組織中細(xì)胞群的全面分析

2.ccRCC細(xì)胞元程序的豐度以及異質(zhì)性

通過非負(fù)矩陣因子分解分析每個樣本scRNA-seq數(shù)據(jù)，得到可以代表ccRCC腫瘤細(xì)胞簇元程序的6個基因集，不同基因集代表著不同的程序，如基因集1代表著EMT（上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變）相關(guān)基因表達(dá)譜，基因集5也與EMT相關(guān)但與基因集1不同的是其包含VEGFA等。

進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)ccRCC亞群0~4簇與不同基因集表達(dá)譜匹配，5和6簇不與任何基因集匹配但具有細(xì)胞周期和應(yīng)激響應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)。RCC0簇和RCC2簇代表EMThigh腫瘤細(xì)胞并在IF區(qū)域富集，RCC1簇代表PT（近曲小管）細(xì)胞，擬時(shí)序分析結(jié)果顯示存在RCC0—>RCC2分化關(guān)系，但RCC2幾乎只在P2患者樣本中發(fā)現(xiàn)，表明RCC2可能與個別患者特征相關(guān)。RCC1、RCC3和RCC4細(xì)胞主要在組織而不是腫瘤區(qū)域富集，RCC4主要分布在AN和DN區(qū)域，RCC4在AN區(qū)域分布數(shù)量高于DN區(qū)域。RCC4高表達(dá)細(xì)胞因子受體基因，表明TME中分泌的促腫瘤細(xì)胞因子可能傾向于作用到RCC4，增加其轉(zhuǎn)變成癌細(xì)胞的概率，加速腫瘤逃逸，促進(jìn)腫瘤惡性化，與以往瘤旁附近不是完全的健康組織認(rèn)識相符合。

圖2-透明細(xì)胞RCC細(xì)胞元程序的豐度及異質(zhì)性

3.ccRCC基質(zhì)細(xì)胞的區(qū)域化特征和異質(zhì)性

scRNA-seq與空間數(shù)據(jù)均顯示，ccRCC存在8種激活的成纖維細(xì)胞簇，腫瘤區(qū)域成纖維細(xì)胞數(shù)量高于健康組織，其中CD24+IL32+成纖維細(xì)胞顯著富集在腫瘤區(qū)域，PTGDS+成纖維細(xì)胞幾乎全分布在AN，高表達(dá)ECM（胞外基質(zhì)）形成和EMT的成纖維細(xì)胞簇在IF較為富集，IL1R1+?CAF（腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞）表現(xiàn)出腫瘤促進(jìn)表型；7種EC（內(nèi)皮細(xì)胞）簇中4種（0,2,3和6）主要富集在腫瘤組織，3種（1,4和5）在健康組織富集，膠原蛋白EC（0簇）豐度最高，具有促腫瘤特征。總之，不同的ECM蛋白質(zhì)產(chǎn)生基質(zhì)細(xì)胞傾向于富集在IF并共定位，可能行駛多種功能，包括細(xì)胞-細(xì)胞交互和胞外組分重構(gòu)。

圖3-透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中基質(zhì)細(xì)胞的區(qū)域特征和異質(zhì)性

4.ccRCC中MRC1+FOLR2+?TAM傾向于表現(xiàn)出更強(qiáng)的促癌表型

scRNA-seq數(shù)據(jù)與空間數(shù)據(jù)均顯示，4種TAM簇具有不同分布趨勢，TAM1主要分布在TC區(qū)域；TAM2高表達(dá)FOLR2、MRC1和CD163，可能是M2樣巨噬細(xì)胞且具有增強(qiáng)的免疫抑制特征，TAM4是組織駐留巨噬細(xì)胞，兩者主要分布在TR區(qū)域；TAM3表達(dá)炎癥響應(yīng)相關(guān)基因，在TR和AN區(qū)域富集。RNA速率分析顯示存在TAM4—>TAM2—>TAM1和TAM4—>TAM3兩種軌跡，以及從IF區(qū)域遷移到TC區(qū)域的趨勢。進(jìn)一步的功能分析顯示，IF區(qū)域的TAM2可能通過促進(jìn)EMT，TC區(qū)域的TAM2可能通過促進(jìn)腫瘤血管生成，起到促癌效應(yīng)。總之，TAM2不同的腫瘤促進(jìn)效應(yīng)可能與免疫抑制TME有關(guān)。

圖4-透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中MRC1+FOLR2+?TAM傾向于表現(xiàn)更強(qiáng)的促癌表型

5.單細(xì)胞分析揭示ccRCC中存在表達(dá)IL1B的Treg

進(jìn)一步分析CD4+ T細(xì)胞簇，發(fā)現(xiàn)存在CD4+ 初始T細(xì)胞、Treg和濾泡樣輔助T細(xì)胞，不同簇的特征基因和空間分布模式不同，IF區(qū)域富集CD4+ 初始T細(xì)胞和PDE3B+ CD4+ T細(xì)胞，腫瘤區(qū)域富集Treg。其中，TC/TR區(qū)域CTLA-4+?Treg的占比以及Treg的FoxP3蛋白表達(dá)水平高于AN/DN區(qū)域，而CTLA-4+FoxP3-?Treg在所有組織中的分布較為均勻，表明腫瘤區(qū)域Treg細(xì)胞具有更強(qiáng)的免疫抑制功能。

進(jìn)一步分析Treg細(xì)胞簇，發(fā)現(xiàn)存在6種亞型，其中終末效應(yīng)Treg細(xì)胞（5）主要分布在IF區(qū)域，F(xiàn)OXP3表達(dá)水平較低且ICOS表達(dá)水平降低，表明細(xì)胞可能處于不穩(wěn)定狀態(tài)。

此外，終末效應(yīng)Treg細(xì)胞表達(dá)炎癥性細(xì)胞因子如IL1B，IL18和IL7，驗(yàn)證隊(duì)列的多重免疫熒光染色結(jié)果顯示IL-1β+終末效應(yīng)Treg是對ccRCC特異性腫瘤微環(huán)境信號的特異性響應(yīng)。發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中存在表達(dá)炎癥性細(xì)胞因子IL1B的終末效應(yīng)Treg細(xì)胞。

圖5-單細(xì)胞分析揭示透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌存在表達(dá)IL1B的Treg細(xì)胞群

6.IL-18通過ERK/NF-κB通路促進(jìn)強(qiáng)免疫抑制功能的終末效應(yīng)Treg細(xì)胞產(chǎn)生

空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果顯示不同Treg細(xì)胞100μm范圍內(nèi)激活的CD4+/CD8+ T細(xì)胞數(shù)量較少，終末效應(yīng)Treg細(xì)胞100μm范圍內(nèi)CD4+/CD8+ T細(xì)胞數(shù)量更少，表明終末效應(yīng)Treg細(xì)胞周圍應(yīng)答Treg細(xì)胞（Tresp）增殖受到更強(qiáng)的抑制。細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明終末效應(yīng)Treg細(xì)胞具有強(qiáng)免疫抑制功能。RNA速率分析結(jié)果表明效應(yīng)終末Treg可能由初始Treg細(xì)胞分化而來，體外實(shí)驗(yàn)表明IL-18可刺激CD4+CD25+ Treg細(xì)胞上調(diào)IL-1β表達(dá)，表明終末效應(yīng)Treg細(xì)胞產(chǎn)生和作用可能與IL-18有關(guān)。ERK激活劑/NF-κB激活劑促進(jìn)IL-18+ Treg細(xì)胞的產(chǎn)生，IL-18處理后Treg細(xì)胞ERK/NF-κB磷酸化水平增加，ERK抑制劑可抑制Treg細(xì)胞表達(dá)NF-κB但NF-κB抑制劑無法抑制ERK表達(dá)，綜上，這些結(jié)果表明IL-18可能通過ERK/NF-κB通路介導(dǎo)終末效應(yīng)Treg細(xì)胞的產(chǎn)生。

圖6-IL-18通過ERK/NF-κB通路促進(jìn)具有強(qiáng)免疫抑制功能的終末效應(yīng)Treg細(xì)胞產(chǎn)生

7.通過與MRC1+FLOR2+?TAM互作，終末效應(yīng)Treg細(xì)胞與存活率降低、免疫逃逸增加及腫瘤生長相關(guān)

確定終末效應(yīng)Treg細(xì)胞標(biāo)志基因（FOXP3、IL1B和FCER1G），TGCA泛癌數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，終末效應(yīng)T細(xì)胞浸潤高的隊(duì)列與更低的整體存活率相關(guān)。細(xì)胞通訊分析結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞與終末效應(yīng)Treg細(xì)胞有著最多的互作配體-受體對，許多是免疫抑制互作，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)支持終末效應(yīng)Treg細(xì)胞與TAM2簇之間存在相互作用；IL1R1+?CAF與終末效應(yīng)Treg細(xì)胞也存在潛在聯(lián)系。僅在TC區(qū)域（與TR區(qū)域相比）發(fā)現(xiàn)NAMPT-INSR和TGFB1-(TGFBR1+TGFBR2)配受體互作，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)終末效應(yīng)Treg細(xì)胞LRRC32（該基因編碼的GARP是TGF-β1成熟和激活所必須的）表達(dá)水平高于傳統(tǒng)Treg細(xì)胞。

此外，巨噬細(xì)胞特別是TAM2高表達(dá)IL18。這些結(jié)果可能表明ccRCC腫瘤微環(huán)境中，IF區(qū)域終末效應(yīng)Treg細(xì)胞與臨近TAM2互作，通過分泌的TGF-β1、M-CSF1以及IL-10，將IF駐留的TAM轉(zhuǎn)變成促癌表型，引起腫瘤細(xì)胞EMT；TAM2分泌的趨化因子誘導(dǎo)Treg細(xì)胞遷移到腫瘤區(qū)域并過表達(dá)IL-18，將Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)變成IL-1β+ 終末效應(yīng)T細(xì)胞，抑制T細(xì)胞免疫并促進(jìn)腫瘤生長。

總之，這些結(jié)果表明ccRCC的IF區(qū)域，終末效應(yīng)Treg細(xì)胞可能與其他促癌細(xì)胞互作，最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，支持了終末效應(yīng)Treg細(xì)胞具有免疫抑制和促癌作用的假設(shè)。

研究結(jié)果

該研究系統(tǒng)描述了ccRCC中不同類型細(xì)胞的基因表達(dá)譜和空間分布規(guī)律，發(fā)現(xiàn)一種具有癌癥促進(jìn)作用的新Treg細(xì)胞亞型，在腫瘤-健康組織交界區(qū)域與MRC1+FOLR2+?TAM互作，構(gòu)建免疫抑制TME，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化最終引起患者存活率降低。同時(shí)，這些發(fā)現(xiàn)也為開發(fā)新的藥物和預(yù)后標(biāo)志物提供了靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

Song X, et al. Spatial and single-cell transcriptomics reveal cellular heterogeneity and a novel cancer-promoting Treg cell subset in human clear-cell renal cell carcinoma. J Immunother Cancer. 2025 13(1):e010183.

2025年3月，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院器官移植研究所蘭培祥教授、陳知水教授和肝臟外科程琪教授研究團(tuán)隊(duì)在Journal of Hepatology發(fā)表題為”Sour Neuronal Signalling Attenuates Macrophage Mediated Liver Injury”的研究論文。研究使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)等多種技術(shù)，深入闡述人鼠中減輕肝缺血再灌注損傷的腦-肝軸調(diào)控通路，發(fā)現(xiàn)酸味刺激竟然可以通過神經(jīng)信號緩解肝臟損傷！這一發(fā)現(xiàn)不僅為肝臟疾病的治療提供了新思路，還從現(xiàn)代科學(xué)的角度驗(yàn)證了中醫(yī)“酸入肝”的理論。

文章標(biāo)題：Sour Neuronal Signalling Attenuates Macrophage Mediated Liver Injury

期刊名稱：Journal of Hepatology

影響因子：26.7

合作單位：華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院

百邁客生物為該研究提供了10X單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)服務(wù)。

研究背景

在中醫(yī)理論中，酸味與肝臟有著密切的關(guān)系。中醫(yī)經(jīng)典《黃帝內(nèi)經(jīng)》中提到“酸入肝”，認(rèn)為酸味食物能夠滋養(yǎng)肝臟，調(diào)和氣血，促進(jìn)肝臟的生理功能。像檸檬、山楂、醋等酸味食物，常被用來調(diào)理肝氣郁結(jié)、疏肝解郁。這次的研究，不僅讓中醫(yī)的古老智慧得到了科學(xué)驗(yàn)證，還為酸味在肝臟疾病治療中的應(yīng)用提供了新的依據(jù)。

肝損傷是多種肝病常見的病理生理基礎(chǔ)，與炎癥有關(guān)。肝缺血再灌注損傷是一種局部無菌炎癥響應(yīng)，主要由先天免疫細(xì)胞驅(qū)動，是肝切除術(shù)中早期器官功能障礙和衰竭的重要原因。傳統(tǒng)認(rèn)為肝缺血再灌注引起的炎癥是由肝和死亡細(xì)胞釋放的DAMP（損傷相關(guān)分子蛋白）被肝駐留庫普夫細(xì)胞、單核細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞等識別，釋放趨化因子和促炎癥因子，招募循環(huán)白細(xì)胞促使炎癥發(fā)生。此外，近年來，神經(jīng)免疫調(diào)控成為研究熱點(diǎn)，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)系統(tǒng)可以通過釋放神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)肽等分子來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。然而，如何通過神經(jīng)信號來治療肝臟炎癥，仍然是一個未解之謎。

材料及方法

研究方法：單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測序（n=3，肝及腹腔神經(jīng)節(jié)），組織學(xué)染色，熒光染色，病毒示蹤，免疫印記，免疫沉淀串聯(lián)質(zhì)譜，bulk RNA-seq，qRT-PCR，流式細(xì)胞術(shù)等。

研究材料：C57BL/6J小鼠缺血再灌注損傷模型，Fam19a2-/-Ccr2-/-小鼠，小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT122。

研究結(jié)果

1.酸刺激減輕肝缺血再灌注損傷

研究者首先構(gòu)建酸刺激下肝臟缺血再灌注損傷（IRI）小鼠模型，發(fā)現(xiàn)酸刺激可以減少肝組織損傷以及血清標(biāo)志物水平。但是，使用丁卡因局麻小鼠舌頭或者灌胃檸檬酸不能減少肝損傷和血清標(biāo)志物水平；NMDAR阻斷劑1（阻斷NMDAR介導(dǎo)的興奮性突觸傳遞）立體定位注射到腹后內(nèi)側(cè)核（VPN）后，酸刺激后IRI肝的血清標(biāo)志物水平和肝損傷程度無明顯變化，表明神經(jīng)系統(tǒng)在酸刺激減輕IRI過程中起重要作用。此外，小鼠VPN注射示蹤病毒的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肝臟以及CG（腹腔神經(jīng)節(jié)）均檢測到熒光，行腹腔神經(jīng)節(jié)切除術(shù)能降低IRI肝的組織損傷和血清標(biāo)志物水平，表明酸刺激減輕肝損傷過程通過腦-CG-肝軸。

圖1-酸通過神經(jīng)減輕小鼠肝臟缺血再灌注損傷

圖2-腦和肝中分布的H129感染神經(jīng)

2.酸刺激通過減少TAFA2產(chǎn)生降低肝IRI

對肝IRI小鼠、酸刺激后肝IRI小鼠及sham（假手術(shù)）小鼠的肝臟和CG進(jìn)行單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果顯示IRI引起肝細(xì)胞和神經(jīng)元基因表達(dá)譜發(fā)生變化，IRI肝中免疫細(xì)胞數(shù)量增加，但酸刺激后IRI樣本中免疫細(xì)胞數(shù)量減少。神經(jīng)元較為特異性地表達(dá)TAFA2，IRI可引起肝神經(jīng)元TAFA2表達(dá)水平增加，但酸刺激使得TAFA2表達(dá)水平降到與sham對照組相近水平。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鉀離子可引起小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22顯著高表達(dá)TAFA2，使用鉀離子通道抑制劑可減輕肝損傷，支持酸刺激通過神經(jīng)系統(tǒng)減輕肝損傷的假設(shè)。進(jìn)一步的，使用慢病毒敲低神經(jīng)元TAFA2表達(dá)水平或使用TAFA2敲基因鼠，發(fā)現(xiàn)IRI引起的肝組織損傷、巨噬細(xì)胞浸潤以及血清標(biāo)志物水平降低，表明TAFA2在肝IRI中有著重要作用。

圖3-酸刺激減少小鼠IRI肝中神經(jīng)細(xì)胞Fam19a2表達(dá)水平

圖4-Fam19a2敲除或敲低，使得小鼠肝臟缺血再灌注損傷降低

?3.IRI肝中TAFA2與巨噬細(xì)胞相互作用

體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TAFA2不引起肝細(xì)胞凋亡；snRNA-seq數(shù)據(jù)顯示IRI肝中巨噬細(xì)胞比例增加且炎癥相關(guān)基因表達(dá)水平增加，但在酸刺激組中降低；流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TAFA2與巨噬細(xì)胞結(jié)合而不與T/B細(xì)胞結(jié)合，不論是否酸刺激T/B細(xì)胞比例無顯著變化，IRI肝中CD11b+F4/80low?巨噬細(xì)胞增加而酸刺激可降低該巨噬細(xì)胞數(shù)量；TAFA2敲除或敲低抑制IRI肝中巨噬細(xì)胞的浸潤，這些結(jié)果表明TAFA2促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TAFA2可以激活BMDM（骨髓來源巨噬細(xì)胞），引起Il1α，Il1β，Il6和Tnfα的表達(dá)，這些結(jié)果表明TAFA2激活的巨噬細(xì)胞介導(dǎo)了肝IRI。

圖5-TAFA2使得IRI中巨噬細(xì)胞比例增加，刺激炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生

4.TAFA2通過CCR2與巨噬細(xì)胞互作

體外實(shí)驗(yàn)表明巨噬細(xì)胞上的CCR2是TAFA2受體，CCR2敲除小鼠IRI肝的組織損傷以及巨噬細(xì)胞浸潤降低，血清標(biāo)志物水平降低。TAFA2或CCL2刺激后BMDM的bulk RNA-seq數(shù)據(jù)表現(xiàn)出幾乎一致的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜，粘附、代謝、Ras信號通路相關(guān)差異基因表達(dá)上調(diào)，代謝和核糖體通路相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，TAFA2誘導(dǎo)BMDM更高的表達(dá)Il1α，Il1β，Il6，Tnfα以及干擾素相關(guān)基因，促進(jìn)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥響應(yīng)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明TAFA2促使巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥響應(yīng)主要依賴CCR2，但巨噬細(xì)胞上也可能存在其他的TAFA2受體。

圖6-TAFA2與巨噬細(xì)胞表面CCR2互作

5.酸刺激減輕人類肝切除術(shù)中肝IRI

為了確認(rèn)酸刺激在人類肝IRI中的作用，研究者進(jìn)行了開放、隨機(jī)、空白對照臨床試驗(yàn)（ChiCTR2400088096），包含多種良性/惡性肝腫瘤、肝外傷、膿腫、囊腫和包蟲病，由于手術(shù)期間門靜脈短暫阻斷以減少肝切除過程中出血，導(dǎo)致肝出現(xiàn)缺血再灌注損傷。干預(yù)組33名患者，術(shù)前24h開始，每8h給與新鮮的25mM檸檬酸（持續(xù)5min），對照組33名患者不接受酸刺激，剔除6名術(shù)中肝缺血超過30min患者以及4名依從性差患者，肝切除術(shù)后第1/3/5天對患者肝功能進(jìn)行評估，結(jié)果顯示酸刺激組血清ALT和AST水平顯著低于對照組，高ALT水平（>500 U/L）患者數(shù)量也顯著更低，這些結(jié)果表明酸刺激可減輕人類肝切除術(shù)引起的肝IRI。

圖7-酸刺激減輕人類肝切除術(shù)中肝IRI

研究總結(jié)

該研究首次揭示了腦-肝軸在肝臟IRI中的調(diào)控作用，闡明了酸味刺激通過神經(jīng)信號通路緩解肝臟損傷的機(jī)制。研究不僅為肝臟IRI的治療提供了新的思路，還為神經(jīng)免疫調(diào)控在其他器官炎癥中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。研究團(tuán)隊(duì)表示，未來將進(jìn)一步探索神經(jīng)刺激療法在肝臟疾病中的應(yīng)用，特別是通過調(diào)控腦-肝軸來緩解肝臟炎癥和損傷。此外，研究團(tuán)隊(duì)還將深入研究TAFA2蛋白的作用機(jī)制，開發(fā)針對TAFA2-CCR2信號通路的靶向藥物，為肝臟疾病的治療提供更多選擇。

• 發(fā)表期刊：Cancer Cell
• 影響因子：48.8
• 發(fā)表日期：2025-2-6
• 發(fā)表單位：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院
• 課題切入點(diǎn)：本文研究了三陰性乳腺癌（TNBC）中不同治療方案對腫瘤免疫微環(huán)境（TME）的影響，特別是探討了化療與程序性死亡配體1（PD-L1）阻斷聯(lián)合療法的細(xì)胞機(jī)制。
• 研究?材料?：研究從44名TNBC患者中獲取了78份腫瘤活檢樣本，包括接受nab-紫杉醇（Nab-PTX）聯(lián)合阿替利珠單抗（ATZ）、Nab-PTX單藥、紫杉醇（PTX）聯(lián)合ATZ以及PTX單藥治療的患者。
• 研究方法?：采用單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）和T細(xì)胞受體測序（TCR-seq）技術(shù)，對TNBC中的免疫細(xì)胞浸潤進(jìn)行了詳細(xì)分析。此外，還利用小鼠4T1乳腺癌模型進(jìn)行了體內(nèi)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，包括RNA測序和流式細(xì)胞術(shù)分析。?·?研究結(jié)論?：研究發(fā)現(xiàn)，不同治療方案下，TNBC中的免疫細(xì)胞組成發(fā)生顯著變化。Nab-PTX聯(lián)合ATZ治療顯著減少了耗竭性CD8+T細(xì)胞（Tex）的比例，同時(shí)增加了具有干細(xì)胞樣特征的中央記憶T細(xì)胞（Tcm）和效應(yīng)記憶T細(xì)胞（Tem）的比例。B細(xì)胞亞群，特別是濾泡B細(xì)胞（Bfoc），在Nab-PTX聯(lián)合ATZ治療的響應(yīng)者中顯著富集，且B細(xì)胞水平與有利反應(yīng)相關(guān)。此外，研究還揭示了不同DC亞群之間的轉(zhuǎn)化關(guān)系，以及它們與T細(xì)胞反應(yīng)之間的相互作用。肥大細(xì)胞在Nab-PTX相關(guān)治療中顯示出增加的趨勢，且其浸潤水平與有利反應(yīng)相關(guān)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了肥大細(xì)胞激活可以增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而提高PD-L1阻斷療法的有效性。

這些發(fā)現(xiàn)不僅增進(jìn)了我們對TNBC中免疫細(xì)胞動態(tài)及其與治療反應(yīng)之間關(guān)系的理解，還為開發(fā)新的化療免疫聯(lián)合療法提供了潛在的治療靶點(diǎn)。

• 發(fā)表期刊：Annals of Oncology
• 影響因子：56.7
• 發(fā)表日期：2025-2-4
• 發(fā)表單位：英國倫敦癌癥研究所和英國倫敦皇家馬斯登醫(yī)院
• 課題切入點(diǎn)：該研究探討了基于全基因組測序（WGS）的超靈敏循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）檢測技術(shù)在早期乳腺癌分子殘留病灶（MRD）監(jiān)測和復(fù)發(fā)預(yù)測中的應(yīng)用。· 研究樣本：研究團(tuán)隊(duì)分析了78例早期乳腺癌患者（包括23例三陰性乳腺癌、35例HER2陽性、18例HR陽性及2例未知亞型）的617份血漿樣本，覆蓋診斷前、新輔助化療期間、術(shù)后及長期隨訪（中位隨訪76個月）多個時(shí)間點(diǎn)?；颊哐獫{樣本來自英國多家醫(yī)療中心，包括診斷前、新輔助化療周期、術(shù)后及定期隨訪樣本。
• 研究方法：對腫瘤組織進(jìn)行全基因組測序（中位深度38×），篩選高可信度體細(xì)胞變異構(gòu)建個性化檢測panel。血漿游離DNA（cfDNA）經(jīng)高通量測序后，通過分子共識算法抑制背景噪聲，計(jì)算ctDNA水平。所有樣本通過NeXT Personal MRD平臺進(jìn)行檢測，該平臺基于腫瘤組織的全基因組測序數(shù)據(jù)，為每位患者個性化設(shè)計(jì)檢測panel，追蹤中位數(shù)1451個體細(xì)胞變異，檢測靈敏度可達(dá)百萬分之一（1 PPM）。
• 數(shù)據(jù)分析：采用Kaplan-Meier生存分析和Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型評估ctDNA檢測與臨床結(jié)局（復(fù)發(fā)無生存期RFS、癌癥特異性生存期CSS）的關(guān)聯(lián)，并通過時(shí)間依賴性模型動態(tài)評估MRD狀態(tài)對預(yù)后的影響。
• 研究結(jié)果：1. 診斷階段：98%（49/50）的患者在治療前檢測到ctDNA，涵蓋所有亞型（HER2+和TNBC均為100%，HR+為88%）。診斷時(shí)ctDNA水平升高與較差的RFS（HR=1.82）和CSS（HR=2.19）顯著相關(guān)。2. 術(shù)后監(jiān)測：所有復(fù)發(fā)患者（11/11）在臨床復(fù)發(fā)前均檢測到ctDNA（中位提前15個月），未檢測到ctDNA的患者（64/64）均未復(fù)發(fā)。術(shù)后ctDNA陽性與RFS和CSS顯著惡化相關(guān)（均P<0.0001）。3. 靈敏度優(yōu)勢：39%的ctDNA陽性樣本處于超低水平（<100 PPM）。與全外顯子測序（WES）和數(shù)字PCR（dPCR）相比，WGS方法在匹配樣本中檢測率更高（WGS 100% vs. WES 84% vs. dPCR 76%）。4. 動態(tài)預(yù)后：術(shù)后6周或6個月未檢測到ctDNA的患者預(yù)后顯著改善。此外，術(shù)后早期ctDNA清除（如輔助治療后）可能提示疾病控制良好。
• 研究結(jié)論：WGS驅(qū)動的超靈敏ctDNA檢測技術(shù)顯著提升了早期乳腺癌MRD監(jiān)測的敏感性和特異性，可提前預(yù)測復(fù)發(fā)并指導(dǎo)臨床決策。其高陰性預(yù)測值（NPV 100%）支持在低風(fēng)險(xiǎn)患者中探索治療降階梯策略，而陽性結(jié)果則為早期干預(yù)提供了依據(jù)。未來需擴(kuò)大樣本量并開展前瞻性研究以驗(yàn)證其臨床實(shí)用性。

Ps：關(guān)注醫(yī)學(xué)領(lǐng)域腫瘤研究請聯(lián)系當(dāng)?shù)貥I(yè)務(wù)經(jīng)理獲取原文~

本次為各位老師帶來重慶醫(yī)科大學(xué)黃愛龍教授/唐開福教授團(tuán)隊(duì)在nature子刊?Nature Communications?中發(fā)表的題目為“SARS-CoV-2 N protein-induced Dicer, XPO5, SRSF3, and hnRNPA3 downregulation causes pneumonia”的文章。該文章研究了 SARS-CoV-2 N 蛋白如何影響 RNA 干擾 (RNAi) 和 RNA 剪接途徑，并揭示了這些途徑在 COVID-19 發(fā)病機(jī)制中的作用，有助于開發(fā)更有效的 SARS-CoV-2 相關(guān)肺炎治療方法。

中文題目：SARS-CoV-2 N蛋白誘導(dǎo)的Dicer、XPO5、SRSF3和hnRNPA3下調(diào)導(dǎo)致肺炎

英文題目：SARS-CoV-2 N protein-induced Dicer, XPO5, SRSF3, and hnRNPA3 downregulation causes pneumonia

發(fā)表期刊：Nature Communications?

影響因子：14.7

合作單位：重慶醫(yī)科大學(xué)

百邁客生物為該研究提供了小RNA測序和ONT全長轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)。

研究背景

2019 冠狀病毒病 （COVID-19） 由嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒 2 （SARS-CoV-2） 引起，具有高度異質(zhì)性，且發(fā)病病例分布在各個年齡群體中，但重癥及死亡率明顯字老年群體比較集中。DNA 損傷是導(dǎo)致衰老的關(guān)鍵因素，也是 COVID-19 發(fā)病機(jī)制的驅(qū)動因素，蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)喪失是衰老的另一個標(biāo)志，會導(dǎo)致不受抑制的炎性小體激活、功能失調(diào)的細(xì)胞器積累和細(xì)胞損傷，可能導(dǎo)致 COVID-19 的發(fā)病機(jī)制。Dicer 是 RNA 干擾 （RNAi） 通路的關(guān)鍵組成部分，在衰老過程中下調(diào)， RNAi 組分的敲除會導(dǎo)致 DNA 損傷，并且可能由于 miRNA的整體下調(diào)而增加蛋白質(zhì)合成，從而影響蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，與年齡相關(guān)的剪接因子失調(diào)發(fā)生在不同生物體的多個組織中，并且與基因組穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)有關(guān)，可通過R環(huán)誘導(dǎo) DNA 損傷。然而，RNAi 成分及RNA 剪接因子在 COVID-19 發(fā)病機(jī)制中的確切作用還有待明確。

材料和方法

材料：異位表達(dá) N 蛋白的人肺癌 （A549） 和人正常肺上皮 （BEAS-2B） 細(xì)胞系 ，N 蛋白誘導(dǎo)的雄性肺損傷小鼠及正常對照 C57BL/6J 雄性小鼠；

方法：小RNA測序+ONT全長轉(zhuǎn)錄組+免疫組化+RIP等

研究結(jié)果

1.SARS-CoV-2核衣殼 （N） 蛋白誘導(dǎo)自噬降解及DNA損傷的作用機(jī)制

通過對已發(fā)表的COVID-19 患者RNA測序數(shù)據(jù)的分析，確定了重癥 COVID-19 患者 M-MDSC 中 RNAi 成分和剪接因子的 mRNA 水平低于無癥狀 COVID-19 患者，且已故 COVID-19 患者肺組織中的 RNAi 成分和剪接因子水平也低于未感染 COVID-19 的個體，表明RNAi 成分和剪接因子的表達(dá)減少與 COVID-19 感染加重有關(guān)。

細(xì)胞沉默逆轉(zhuǎn)測定使用含有內(nèi)含子的熒光素酶報(bào)告基因小基因證明了 SARS-CoV-2 抑制了該小基因的剪接。該研究從相互作用數(shù)據(jù)集的生物通用存儲庫 （BioGRID） 中檢索了 N 蛋白的推定蛋白質(zhì)相互作用子，并用免疫共沉淀測定證實(shí)了異位表達(dá) N 蛋白的人肺癌 （A549） 和人正常肺上皮 （BEAS-2B） 細(xì)胞系中 N 蛋白與?Dicer、XPO5、SRSF3和hnRNPA3?之間的相互作用，進(jìn)一步定量測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2 感染導(dǎo)致?Dicer、XPO5、SRSF3和hnRNPA3在蛋白水平上下調(diào)，但在 mRNA 水平上不下調(diào)，而自噬抑制劑氯喹或巴弗洛霉素 A1 治療可緩解 N 蛋白或 SARS-CoV-2 誘導(dǎo)的?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?下調(diào)，用蛋白酶體抑制劑 MG132 處理并無效果，表明?N 蛋白對?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?蛋白表達(dá)的影響是自噬依賴性的。

在 BioGRID 數(shù)據(jù)庫中找到了一種自噬受體蛋白SQSTM1/p62 ，共聚焦顯微鏡分析和免疫共沉淀分析分別證實(shí)了 N 蛋白和 p62 之間的相互作用及其共定位，p62 敲低部分緩解了 N 蛋白誘導(dǎo)的?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?蛋白的下調(diào)；然而，它不會影響不表達(dá) N 蛋白的細(xì)胞中的?Dicer、XPO5、SRSF3?或?hnRNPA3?蛋白水平，表明?p62 通過與 N 蛋白的相互作用將 N 蛋白相互作用蛋白（包括?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3）募集到吞噬細(xì)胞中，導(dǎo)致自噬降解。

ATM等的磷酸化、DNA 斷裂積累等病灶形成證明了異位 N 蛋白表達(dá)或 SARS-CoV-2 感染誘導(dǎo)了 DNA 損傷，敲低?Dicer、XPO5、SRSF3?或?hnRNPA3?導(dǎo)致 DNA 損傷，而它們的過表達(dá)部分減輕了 N 蛋白誘導(dǎo)的 DNA 損傷，同時(shí)異位 N 蛋白表達(dá)或 SARS-CoV-2 感染誘導(dǎo)了 R 環(huán)積累，進(jìn)一步誘導(dǎo)DNA損傷，RNase H1（一種降解 R 環(huán)的 RNA 部分的核糖核酸內(nèi)切酶）的過表達(dá)部分減輕了這種影響并減少了 DNA 損傷積累，總的來說，這些發(fā)現(xiàn)表明?N 蛋白誘導(dǎo)的 Dicer 、 XPO5 、 SRSF3 和 hnRNPA3 表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致 DNA 損傷。

2.SARS-CoV-2 N蛋白通過抑制 miRNA 生物發(fā)生及抑制 RNA 剪接作用機(jī)制

XPO5和Dicer在 miRNA 生物合成中起關(guān)鍵作用，小 RNA 深度測序顯示，N 蛋白誘導(dǎo) miRNA 表達(dá)的整體下調(diào)，對 A549 和 BEAS-2B 細(xì)胞中表達(dá)量最高的前五個 miRNA進(jìn)行定量驗(yàn)證顯示，它們在表達(dá) N 蛋白的細(xì)胞和 SARS-CoV-2 感染的細(xì)胞中均下調(diào)；生化分級分離實(shí)驗(yàn)顯示，異位 N 蛋白表達(dá)或 SARS-CoV-2 感染誘導(dǎo) pre-miRNA 的核保留，如細(xì)胞核中 pre-miRNA 水平的增加和細(xì)胞質(zhì)中 pre-miRNA 水平的降低所示，?XPO5過表達(dá)后得到緩解。此外，異位 N 蛋白表達(dá)或 SARS-CoV-2 感染降低了成熟 miRNA 和 pre-miRNA 之間的比率，Dicer過表達(dá)后得到緩解?？傮w而言，這些發(fā)現(xiàn)表明，N 蛋白通過降低?XPO5?表達(dá)阻斷 pre-miRNA 從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的運(yùn)輸，并通過下調(diào)?Dicer?表達(dá)抑制 pre-miRNA 向成熟 miRNA 的加工。

SRSF3或hnRNPA3敲除抑制了含有內(nèi)含子的報(bào)告基因小基因的剪接，證實(shí)了它們確實(shí)是剪接因子，而它們的過表達(dá)部分緩解了 N 蛋白或 SARS-CoV-2 感染對 RNA 剪接的抑制作用，進(jìn)一步進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄組測序，通過可變剪接分析發(fā)現(xiàn)，N 蛋白誘導(dǎo)內(nèi)含子保留。此外，RT-qPCR證實(shí)，異位 N 蛋白表達(dá)或 SARS-CoV-2 感染降低了一組內(nèi)源性內(nèi)含子的剪接效率，SRSF3?和?hnRNPA3?過表達(dá)部分減輕了 N 蛋白和 SARS-CoV-2 對 RNA 剪接的抑制作用，這些結(jié)果表明，N 蛋白通過降低?SRSF3?和?hnRNPA3?的表達(dá)來抑制 RNA 剪接。

剪接抑制會誘導(dǎo)廣泛的 IR 和隨后的內(nèi)含子保留 mRNA 的翻譯，一部分內(nèi)含子衍生的多肽容易縮合且具有蛋白毒性，用嘌呤霉素對新生多肽進(jìn)行代謝標(biāo)記，結(jié)果顯示異位 N 蛋白表達(dá)或 SARS-CoV-2 感染誘導(dǎo)不溶性蛋白合成增加，而N蛋白與RNA的結(jié)合主要在可溶性蛋白部分被檢測到，免疫熒光檢測結(jié)果表明，N 蛋白和 SARS-CoV-2 感染誘導(dǎo)了 EGFP 聚集體的產(chǎn)生，誘導(dǎo)蛋白毒性應(yīng)激。

3.SARS-CoV-2 N 蛋白在蛋白水平的影響及動物模型驗(yàn)證

盡管異位 N 蛋白表達(dá)或 SARS-CoV-2 感染導(dǎo)致 4EBP1 去磷酸化，但它增加了整體蛋白質(zhì)合成，而沒有顯著影響 S6K1 磷酸化，對照組的刺突蛋白和膜蛋白對整體蛋白質(zhì)合成沒有影響，而包膜蛋白甚至抑制了整體蛋白質(zhì)合成，Dicer?或?XPO5?敲低導(dǎo)致 JNK 激活和 4EBP1 去磷酸化，同時(shí)略微增加 S6K1 磷酸化并促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，表明 N 蛋白通過降低?Dicer?和?XPO5?表達(dá)來促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，并通過下調(diào)?SRSF3?和?hnRNPA3?表達(dá)來抑制蛋白質(zhì)合成。由于?Dicer?和?XPO5?的下調(diào)比?SRSF3?和?hnRNPA3?的下調(diào)更顯著地促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，因此 N 蛋白最終增強(qiáng)了蛋白質(zhì)合成。

小鼠體內(nèi)驗(yàn)證結(jié)果顯示， N 蛋白在小鼠肺組織中的表達(dá)導(dǎo)致?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?下調(diào)、DNA 損傷、胞質(zhì) DNA 積累、細(xì)胞凋亡、IFNβ、IL-6 和 NKG2D 配體上調(diào)，以及伴有明顯巨噬細(xì)胞浸潤的肺炎，肺組織中?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?敲低導(dǎo)致肺損傷和肺炎，而它們的過表達(dá)部分緩解了 N 蛋白誘導(dǎo)的肺炎，這些結(jié)果表明，N 蛋白誘導(dǎo)的?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?蛋白表達(dá)下調(diào)是 SARS-CoV-2 誘導(dǎo)肺炎的一種機(jī)制。

分析已發(fā)表的 3、6、12 和 24 個月齡 C57BL/6J 小鼠肺組織的 RNA 測序數(shù)據(jù)，在 8 周齡和 18 個月齡 C57BL/6J 小鼠的 mRNA 和蛋白質(zhì)水平上證實(shí)了肺組織中?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?的年齡依賴性下調(diào)， DNA 損傷、細(xì)胞凋亡等功能在老年小鼠中明顯富集，結(jié)合Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?敲低實(shí)驗(yàn)，表明，Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?的年齡相關(guān)下調(diào)與 N 蛋白誘導(dǎo)的肺炎嚴(yán)重程度增加有關(guān)。

PJ34 是一種（ADP-核糖）聚合酶 （PARP） 抑制劑，免疫沉淀結(jié)果表明 PJ34 通過阻止 N 蛋白誘導(dǎo)的?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?的下調(diào)來緩解肺炎，阿那曲唑是一種增強(qiáng) Dicer 表達(dá)的芳香化酶抑制劑，WB結(jié)果表明，阿那曲唑通過促進(jìn)?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?的表達(dá)來緩解 SARS-CoV-2 N 蛋白誘導(dǎo)的肺炎。

思路發(fā)散

本研究通過數(shù)據(jù)庫檢索及分子實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證先初步推測SARS-CoV-2 N蛋白的年齡依賴調(diào)控機(jī)制與RNAi以及可變剪接相關(guān)，之后通過組學(xué)測序在整體水平上驗(yàn)證了猜測并進(jìn)一步細(xì)化了調(diào)控方式，之后再通過大量過表達(dá)及敲降后對應(yīng)分子在RNA及蛋白水平的定量驗(yàn)證了結(jié)果，是一個比較經(jīng)典有效的實(shí)驗(yàn)思路，可以在其他實(shí)驗(yàn)中參考。

參考文獻(xiàn)：

Luo YW, Zhou JP, Ji H, Xu D, Zheng A, Wang X, Dai Z, Luo Z, Cao F, Wang XY,Bai Y, Chen D, Chen Y, Wang Q, Yang Y, Zhang X, Chiu S, Peng X, Huang AL, Tang KF. SARS-CoV-2 N protein-induced Dicer, XPO5, SRSF3, and hnRNPA3 downregulation causes pneumonia.?Nat Commun. 2024 Aug 13;15(1):6964. doi:10.1038/s41467-024-51192-1.

本期為各位老師帶來一篇關(guān)于小RNA及l(fā)ncRNA研究的高分經(jīng)典案例解讀，希望能為各位老師后續(xù)研究激發(fā)新的研究思路~

中文題目：Klotho衍生肽1通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控恢復(fù)Klotho表達(dá)抑制纖維化腎臟細(xì)胞衰老

英文題目：Klotho-derived peptide 1 inhibits cellular senescence in the fibrotic kidney by restoring Klotho expression via posttranscriptional regulation[2]

合作單位：南方醫(yī)科大學(xué)

發(fā)表期刊：Theranostics?

影響因子：12.4

百邁客生物為該研究提供了miRNA測序服務(wù)。

研究背景

慢性腎?。–KD）是一種持續(xù) 3 個月以上的腎功能不全病癥，特征通常是細(xì)胞衰老增加、表觀遺傳重編程、持續(xù)的成纖維細(xì)胞活化和持續(xù)的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）產(chǎn)生，與老年腎臟存在很多相似之處，因此，CKD現(xiàn)在被認(rèn)為是一種腎臟過早和加速衰老的狀態(tài)?？顾ダ系鞍?Klotho 屬于由α和β亞型組成的單跨膜蛋白小家族，腎損傷會導(dǎo)致Klotho表達(dá)下調(diào)，Klotho 缺乏可導(dǎo)致高磷血癥、腎小管細(xì)胞衰老和腎纖維化等，進(jìn)一步加速 CKD的進(jìn)展，因此Klotho 被認(rèn)為是腎臟疾病診斷和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

然而由于Klotho 是一種大型跨膜蛋白，臨床生產(chǎn)成本高且難度大，因此作者團(tuán)隊(duì)在前期報(bào)道了Klotho衍生肽1（KP1） 的發(fā)現(xiàn)，可通過結(jié)合TGF-β 受體2（TβR2） 并抑制 TGF-β/Smad3 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來減輕腎纖維化，且生產(chǎn)上會更便捷經(jīng)濟(jì)，有可能替代 Klotho 進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化，為了進(jìn)一步研究 KP1 在保護(hù)腎臟中的作用，作者在本篇研究中檢查了其對細(xì)胞衰老的影響。

材料方法

材料：8-10周齡雄性C57BL/6小鼠假手術(shù)組（sham）、單側(cè)缺血再灌注損傷（UIRI）組別小鼠和治療組別小鼠（UIRI + KP1）共三組小鼠腎臟組織；

方法：miRNA測序+雙熒光素酶報(bào)告基因檢測+RNA 熒光原位雜交等

研究結(jié)果

WB檢測了許多細(xì)胞衰老標(biāo)志物如p21、p16和γ-H2AX的表達(dá)，結(jié)果表明了UIRI 誘導(dǎo)纖維化腎中對應(yīng)標(biāo)志物的表達(dá)，而KP1明顯消除了這種誘導(dǎo)。此外針對其內(nèi)源Klotho 的檢測也證明UIRI 導(dǎo)致腎臟中Klotho 的丟失而KP1在很大程度上恢復(fù)了它們的表達(dá)，單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）誘導(dǎo)的 CKD 模型以及體外細(xì)胞模型中也出現(xiàn)了類似的結(jié)果，此外，UIRI 還導(dǎo)致 Klotho mRNA 的顯著下調(diào)。然而，KP1 不影響 Klotho mRNA 的穩(wěn)態(tài)水平，說明KP1通過獨(dú)立于轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)制誘導(dǎo) Klotho。

此外，通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行的細(xì)胞周期分析表明，TGF-β1 孵育后的衰老原代腎小管細(xì)胞停滯在 G1 期，這被 KP1 處理抵消，證明了KP1阻斷細(xì)胞衰老的能力，而在可以阻斷新mRNA合成的放線菌素D（ActD）存在下與 TGF-β1 孵育后 12 小時(shí)和 24 小時(shí)，KP1 不會影響 Klotho mRNA 水平，進(jìn)一步證實(shí)了 KP1 誘導(dǎo) Klotho 蛋白表達(dá)而不影響其mRNA和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。

由于 KP1 不影響 Klotho mRNA 水平和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，作者開始探索 KP1 是否通過miRNA調(diào)節(jié) Klotho 蛋白，在 UIRI 腎臟中鑒定到了68個上調(diào)miRNA，在注射 KP1 后恢復(fù)到基線，其中 10 個與 Klotho mRNA 的 3′-UTR 特異性結(jié)合，其中miR-223-3p表現(xiàn)非常明顯，且在對公共轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集分析后發(fā)現(xiàn)，miR-223-3p 與 Klotho 水平呈負(fù)相關(guān)，支持了 miR-223-3p 與 Klotho 調(diào)節(jié)的相關(guān)性。

為了證實(shí) miR-223-3p 在 Klotho 表達(dá)中的調(diào)節(jié)作用，作者進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因測定，轉(zhuǎn)染 miR-223-3p 模擬物降低了含有野生型未突變型 Klotho mRNA 序列的報(bào)告基因的熒光素酶活性，表明 miR-223-3p 可以特異性靶向 Klotho mRNA，抑制其活性，用miR-223-3p轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞進(jìn)一步證明miR-223-3p抑制 HK-2 細(xì)胞中 Klotho 蛋白的表達(dá)。體內(nèi)模型原位雜交驗(yàn)證了miR-223-3p 在 UIRI 腎腎小管上皮中被誘導(dǎo)，而KP1抑制了miR-223-3p表達(dá)，結(jié)合免疫熒光染色結(jié)果證明了KP1 可以通過在體內(nèi)抑制 miR-223-3p 來恢復(fù) Klotho 表達(dá)，在體外的HK-2 細(xì)胞中的miR-223-3p及其拮抗劑轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)也呈現(xiàn)出了相同的結(jié)果。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，作者對小鼠模型靜脈注釋miR-223-3p 表達(dá)質(zhì)粒和 KP1構(gòu)建體內(nèi)表達(dá)模型，結(jié)果顯示，miR-223-3p 的過表達(dá)加劇了 p16 、 γ-H2AX 、纖連蛋白、 I 型膠原和 α-SMA 的表達(dá)，所有這些都被 KP1 抑制，而miR-223-3p拮抗素的注射同樣消除了 UIRI 小鼠中的 p21、p16 和 γ-H2AX、纖連蛋白、膠原蛋白 I 和 α-SMA，恢復(fù)了腎功能。而 KP1、SB431542 （TβR1/2 抑制劑） 和 SIS3 （p-Smad3 抑制劑） 處理 TGF-β1 刺激的 HK-2 細(xì)胞結(jié)果進(jìn)一步闡明了，KP1 通過阻斷 TGF-β1/Smad3/miR-223-3p 信號傳導(dǎo)來恢復(fù) Klotho 表達(dá)并防止細(xì)胞衰老。

由于 miRNAs 和 lncRNAs 經(jīng)常相互作用并相互調(diào)節(jié)，作者搜索了幾個 lncRNA-miRNA 相互作用數(shù)據(jù)庫，并預(yù)測 miR-223-3p 和 lncRNA-TUG1 （?；撬嵘险{(diào)基因 1） 具有推定的結(jié)合位點(diǎn)，雙熒光素酶報(bào)告基因測定驗(yàn)證了miR-223-3p 降低了野生型TUG1報(bào)告基因的熒光素酶活性，且在 HK-2 細(xì)胞中過表達(dá) miR-223-3p 抑制了 lncRNA-TUG1，而KP1則消除了這個效果，TGF-β1抑制了HK-2細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-TUG1的表達(dá)，而KP1、SB43154或SIS3則消除了此類效果，這些結(jié)果表明lncRNA-TUG1受TGF-β/Smad信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)。而LncRNA-TUG1 沉默也降低了 Klotho 蛋白，但沒有降低其 mRNA 水平，說明miR-223-3p 可以與 lncRNA-TUG1 相互作用，形成競爭性內(nèi)源性 RNA （ceRNA） 網(wǎng)絡(luò)，從而放大其在調(diào)節(jié) Klotho 表達(dá)和細(xì)胞衰老中的作用。體內(nèi)UUO和UIRI 模型中都驗(yàn)證了這一點(diǎn)。

綜上所述，miR-223-3p 和 lncRNA-TUG1 協(xié)同工作，導(dǎo)致 Klotho 丟失、細(xì)胞衰老和腎纖維化，所有這些都被 KP1 緩解。KP1 是一種新發(fā)現(xiàn)的 Klotho 衍生肽，通過恢復(fù) Klotho 表達(dá)來抑制細(xì)胞衰老，KP1 的這種作用由 miR-223-3p 和 lncRNA-TUG1 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)運(yùn)作。通過恢復(fù) Klotho 表達(dá)，KP1 充當(dāng) Klotho 誘導(dǎo)劑，并具有廣泛的腎保護(hù)特性，例如抗氧化、抗衰老和干細(xì)胞保護(hù)，有望將KP1轉(zhuǎn)化為 CKD 患者的臨床治療。

思路發(fā)散

本研究中利用miRNA測序、公共lncRNA數(shù)據(jù)庫以及公共轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集共同分析出了miRNA與lncRNA共同構(gòu)建ceRNA網(wǎng)絡(luò)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控蛋白表達(dá)的作用機(jī)制，對于較新的研究來說，可以直接通過全轉(zhuǎn)錄組，利用同一來源組織構(gòu)建兩個文庫（lncRNA及小RNA文庫）得到包括lncRNA、miRNA、mRNA以及circRNA的結(jié)果，由此可分析出更可靠的相關(guān)性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，便于篩選關(guān)鍵非編碼RNA。

參考文獻(xiàn)：

[1] Chen LL, Kim VN. Small and long non-coding RNAs: Past, present, and future.Cell. 2024 Nov 14;187(23):6451-6485. doi: 10.1016/j.cell.2024.10.024. PMID:39547208.

[2] Zhang X, Li L, Tan H, Hong X, Yuan Q, Hou FF, Zhou L, Liu Y. Klotho-derived peptide 1 inhibits cellular senescence in the fibrotic kidney by restoring Klotho expression via posttranscriptional regulation. Theranostics. 2024 Jan 1;14(1):420-435. doi: 10.7150/thno.89105. PMID: 38164143; PMCID: PMC10750200.

期刊名稱：cell proliferation.

影響因子：5.9

合作單位：中國醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院

研究部位：大鼠胚胎

研究方法：空間轉(zhuǎn)錄組、免疫熒光、CCK-8、WB、ROS檢測等

百邁客生物為該研究提供了空間轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)。

研究背景

肛門直腸畸形 （ARM） 是兒童常見的先天性消化道畸形，發(fā)病率為 1/5000。ARM 的病因仍然難以捉摸，其發(fā)病機(jī)制與遺傳和環(huán)境因素有關(guān)。最近的研究強(qiáng)調(diào)了遺傳調(diào)控在這一過程中的關(guān)鍵作用。ARM 通常發(fā)生在妊娠 4-8 周，主要在出生后診斷，通常需要手術(shù)干預(yù)作為治療。然而，ARM 患者的長期術(shù)后結(jié)局并不理想，通常會導(dǎo)致并發(fā)癥，例如大便失禁和慢性便秘。這些并發(fā)癥對受影響兒童的生活質(zhì)量和社會心理發(fā)展有重大影響。作者的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析確定了鐵死亡的發(fā)生，這是一種鐵依賴性的程序性細(xì)胞死亡，其特征是活性氧 （ROS） 和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物在 ARM 后腸內(nèi)積累。作者假設(shè)這個過程受活化 C 激酶受體 1 （Rack1） 的調(diào)節(jié)，細(xì)胞質(zhì)蛋白與鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白有相似之處。它在細(xì)胞生長、分化、信號傳導(dǎo)和免疫反應(yīng)中發(fā)揮著多種作用，并且在胚胎神經(jīng)發(fā)育中具有潛在的意義。然而，以前的研究沒有報(bào)道 Rack1 在鐵死亡調(diào)節(jié)中的作用。因此，它在胚胎消化道發(fā)育和 ARM 形成中的作用需要進(jìn)一步探索。

材料方法

使用Wistar 大鼠，在 ARM 組中，大鼠在 GD 10開始口服 1% ETU 125 mL/kg，對照組接受等劑量生理鹽水。從 GDs 14-16取胚胎。

1、空間轉(zhuǎn)錄組測序剖宮產(chǎn)后，立即將取出的胚胎置于冷生理鹽水中以去除表面血。將胚胎以水平矢狀方向放置在含有預(yù)冷OCT的包埋盒中儲存在 -80°C 冰箱中。共計(jì)6份樣品，切片包括尿道和后腸層。2、免疫熒光

選擇清晰全面顯示尿道、后腸、URS 和尿道回瘺的石蠟切片進(jìn)行染色。

研究結(jié)果

1.空間轉(zhuǎn)錄組測序的注釋聚類

在這項(xiàng)研究中，作者在 GDs 14-16 （稱為 N14-16） 上使用正常的 Wistar 大鼠胚胎，在 GDs 14-16 （稱為 A14-16） 上使用 ETU 誘導(dǎo)的 ARM 胚胎進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組測序。制備大鼠胚胎的 6 個冷凍中矢狀切片，每個 10 μm 厚。這些切片包括尿道和后腸層，提供了特定時(shí)間點(diǎn)泄殖腔發(fā)育的全面視圖（圖 1A）。使用 10× Genomics Visium 空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，然后進(jìn)行組織透化、cDNA 合成和文庫構(gòu)建，作者成功地捕獲了正常和 ARM 胚胎中的視覺基因轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)，主要來自泄殖腔區(qū)域。為了確保來自同一區(qū)域的各種切片樣本之間的可比性和一致性，作者進(jìn)行了聚類注釋，產(chǎn)生了七個不同的聚類。這些集群包括泄殖腔區(qū)域內(nèi)的五個特定區(qū)域（集群 0-4），即尿道、后腸、膀胱、URS 和生殖器結(jié)節(jié)。此外，兩個簇 （簇 5 和 6） 對應(yīng)于椎體和神經(jīng)管區(qū)域 （圖 1A）。平均而言，每個解剖區(qū)域覆蓋 3005 個點(diǎn)，每個點(diǎn)捕獲 16,905 個基因（圖 1B）。

圖1-空間轉(zhuǎn)錄組測序的注釋聚類

2.正常組和 ARM 組之間的 DEG 篩選

鑒定 DEG 的標(biāo)準(zhǔn)被確定為絕對對數(shù)2 倍變化 （|log2FC|） ≥ 0.58 且顯著性水平為 p< 0.05. 這種篩選導(dǎo)致了差異火山圖的創(chuàng)建，以說明基因表達(dá)的改變。在 GDs 14、15 和 16 的后腸發(fā)育背景下，作者分別鑒定了 91、439 和 119 個基因，它們在這些時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)出不同的表達(dá)譜（圖 1C）。值得注意的是，Rack1 （Gnb2l1） 在 GDs 15 和 16 上在 ARM 組后腸內(nèi)的表達(dá)降低。為了進(jìn)一步探索潛在的分子相互作用，作者進(jìn)行了全面的 PPI 分析。通過利用 BC 值作為排名標(biāo)準(zhǔn)，作者突出了最顯著的差異表達(dá)后腸基因（圖 1D）。樞紐基因，在環(huán)狀排列中用粉紅色節(jié)點(diǎn)表示，包括 Uba52、Rack1 和 Tpt1，在后腸發(fā)育的 GDs 15 和 16 期間，每個基因在基因網(wǎng)絡(luò)中都具有顯著的中心性。值得注意的是，Rack1 表現(xiàn)出卓越的連通性，在 GD 15 和 16 的 PPI 網(wǎng)絡(luò)中躋身前五名基因之列。

3.在 GD 15 上驗(yàn)證后腸部分 DEGs

圖 2A-E 全面說明了 GD15 截面泄殖腔區(qū)域中前五個基因的蛋白質(zhì)表達(dá)模式和定位：Rack1、Npm1、Eef1b2、Uba52?和?Tpt1。這些數(shù)字是使用免疫熒光染色獲得的。值得注意的是，這 5 種蛋白質(zhì)在 N15 泄殖腔區(qū)域的尿道和后腸上皮內(nèi)均表現(xiàn)出位點(diǎn)特異性表達(dá)。除?Tpt1?外，其他 4 種蛋白在 AM 區(qū)域內(nèi)表現(xiàn)出表達(dá)水平升高。此外，觀察到這些蛋白質(zhì)離散分布在 URS 的下肢和后腸的間質(zhì)附近。相比之下，這五種蛋白的表達(dá)在 A15 泄殖腔區(qū)域的尿道和后腸上皮內(nèi)明顯下降，伴隨著尿道直瘺部位的表達(dá)水平降低 （p < 0.05）。圖 2F 顯示了平均光密度 （AOD） 的半定量評估，特別是在后腸結(jié)構(gòu)域內(nèi)。

圖2-在 GD 15 上驗(yàn)證后腸部分 DEGs

4.PROGENy 算法預(yù)測后腸中 MAPK 信號通路的集中富集

PROGENy 算法用于通過下游基因表達(dá)的變化評估信號通路的活性。作者獲得了正常組和 ARM 組 GDs 14-16 樣本中不同通路的活性水平評分。在使用 NNMF 對后腸區(qū)域（N14 因子 16、A14 因子 15、N15 因子 15、A15 因子 20、N16 因子 18 和 A16 因子 10）進(jìn)行聚類分析中，PROGENy 算法顯示與 MAPK 信號通路呈強(qiáng)正相關(guān)，表明 MAPK 信號在后腸中顯著富集（圖 3A)。從這些區(qū)域提取來自 Erk、P38、JNK 和 Erk5 家族的 12 個成員分子的定位表達(dá)模式。具體來說，Mapk3 、 Mapk6 和 Mapk14 主要富集在泄殖腔區(qū)域。這些蛋白質(zhì)的免疫熒光驗(yàn)證證實(shí)了它們在尿道和后腸區(qū)域的特異性表達(dá)，在 URS 和間質(zhì)區(qū)域的表達(dá)相對較弱，這與 PROGENy 預(yù)測一致（圖 3B）。

圖3-PROGENy 算法預(yù)測后腸中 MAPK 信號通路的集中富集用

5.通過細(xì)胞死亡基因定位探索 Gpx4 的時(shí)空表達(dá)模式

在基因集富集分析（GSEA）數(shù)據(jù)庫中，細(xì)胞死亡基因集包含161個基因，其中 7 個細(xì)胞死亡相關(guān)基因是從基因集與GD 15上簇1中的 DEGs 交集中獲得的（圖 4A）。圓形熱圖顯示了與聚類1的6個樣本相同區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞死亡基因的表達(dá)譜。值得注意的是，發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽過氧化物酶家族的關(guān)鍵成員?Gpx4?在 GD 15 的簇 1 中下調(diào)（p < 0.05；圖 4B）。免疫熒光染色顯示 Gpx4 蛋白在尿道和后腸上皮以及 AM 區(qū)域的顯著定位，在 URS 中觀察到的分布相對較淺。在 ARM 組的泄殖腔中觀察到 Gpx4 陽性信號的減少（圖 4C）。AOD 分析表明，在 GDs 15 和 16 上，后腸中 Gpx4 表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著降低（p < 0.05;圖 4D）。

圖4-通過細(xì)胞死亡基因定位探索 Gpx4 的時(shí)空表達(dá)模式

6.PD-L2 過表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞凋亡并促進(jìn)對 EGFR-TKI 的耐藥

N15 胚胎石蠟切片的雙免疫熒光染色顯示 Rack1 和 Gpx4 蛋白在尿道和后腸上皮內(nèi)共定位。該結(jié)果表明 Rack1 在調(diào)節(jié)這些組織中的鐵死亡中的潛在作用 （圖 4E）。隨后，進(jìn)行顯微解剖以獲得正常和 ARM 胚胎的后腸組織。透射電子顯微鏡 （TEM） 顯示 ARM 組細(xì)胞線粒體體積減小，線粒體密度增加，線粒體嵴減少。這些觀察結(jié)果與與鐵死亡發(fā)生相關(guān)的線粒體形態(tài)變化一致（圖 4F）。

7.Rack1 在 GDs 14 和 16 上的時(shí)空表達(dá)譜

之前描述了 Rack1 蛋白在 GD 15 泄殖腔區(qū)的定位（圖 2A），作者進(jìn)一步研究了它在 GDs 14 和 16 泄殖腔區(qū)的定位。在正常胚胎 （N14） 中，Rack1 陽性信號主要在尿道和后腸的上皮細(xì)胞中觀察到，后腸遠(yuǎn)端的濃度較高。這些信號也分散在 URS 和間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)。在 ARM 胚胎 （A14） 中，在 URS 尖端、后腸和尿道上皮觀察到 Rack1 陽性細(xì)胞（圖 5A）。比較分析顯示，N14 和 A14 組之間 Rack1 陽性信號的 AOD 沒有顯著差異（圖 5B）。在 GD 16 （N16） 的正常大鼠胚胎中，Rack1 表達(dá)在尿道和后腸上皮中仍然突出，但在 URS 和周圍間充質(zhì)區(qū)域受到限制（圖 5A）。值得注意的是，A16 后腸區(qū)域的熒光強(qiáng)度降低 （p < 0.05），如圖 5B 所示，這說明了后腸區(qū)域的半定量 AOD 結(jié)果。

圖5-Rack1 在 GDs 14 和 16 上的時(shí)空表達(dá)譜

8.敲低 Rack1 誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞鐵死亡

在 IEC-6 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 si-Rack1 后，使用 TEM 觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。si-Rack1 組表現(xiàn)出完整的細(xì)胞和核膜，線粒體大小減小，線粒體密度增加。此外，線粒體嵴減少或不存在，類似于 erastin 處理后觀察到的特征（圖 5C）。如 CCK-8 測定中觀察到的 Rack1 敲低導(dǎo)致細(xì)胞活力降低，LDH 測定所示，細(xì)胞毒性增加（p < 0.05；圖 5D）。使用 FerroOrange 探針的熒光分析表明 si-Rack1 組細(xì)胞內(nèi)亞鐵離子濃度升高，在 Fer-1 處理后降低（p < 0.05；圖 5E）。使用 DCFH-DA 探針測量細(xì)胞內(nèi) ROS 水平顯示 si-Rack1 組的 ROS 水平較高，在 Fer-1 處理后下降（p < 0.05；圖 5F）。Liperfluo 探針評估揭示了 Fer-1 能夠減輕 si-Rack1 組中升高的脂質(zhì)過氧化物水平 （p < 0.05；圖 5G）。熒光強(qiáng)度定量結(jié)果如右圖所示。

9.Rack1 敲低可增強(qiáng) P38 磷酸化并調(diào)節(jié)下游 Nqo1/Gpx4 表達(dá)

如前所述，MAPK 信號通路在后腸區(qū)域顯著富集（圖 3A）。在 IEC-6 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 si-Rack1 后，使用 MAPK 信號通路 PCR 陣列在 mRNA 水平上鑒定受 Rack1 影響的下游分子。使用閾值 |log2FC|≥ 2 和 p < 0.05 用于 PCR 陣列差異基因篩選，作者觀察到 si-Rack1 組中 P38δ （Mapk13 encoding） 的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著升高（圖 6A、B）。Western blot 分析顯示，Rack1 敲低后磷酸化 P38 水平增加（圖 6C、D），表明對 Rack1 的干擾增強(qiáng)了 P38 磷酸化，從而激活了 IEC-6 細(xì)胞中的 P38-MAPK 信號通路。隨后，使用鐵死亡 PCR 陣列篩選 si-Rack1 和 doramapimod 處理組之間表現(xiàn)出 mRNA 水平變化的基因，揭示了總共 7 個基因（圖 6E）。此外，這 7 個基因的表達(dá)豐度數(shù)據(jù)與現(xiàn)有研究報(bào)告相結(jié)合，將 Nqo1 確定為下游分子，以供進(jìn)一步研究。Western blotting 分析顯示，doramapimod 處理逆轉(zhuǎn)了 Rack1 敲除誘導(dǎo)的 Nqo1 蛋白水平降低（圖 6F）。此外，在 si-Rack1 組中觀察到的 Gpx4 降低被 doramapimod 抑制，并通過 2-HBA 處理恢復(fù)（圖 6G）。

圖6-Rack1 敲低可增強(qiáng) P38 磷酸化并調(diào)節(jié)下游 Nqo1/Gpx4 表達(dá)

10.Rack1?通過 P38 和 Nqo1 介導(dǎo)腸上皮細(xì)胞中的鐵死亡

在 IEC-6 細(xì)胞敲低 Rack1 的同時(shí)，使用 doramapimod 和 2-HBA 進(jìn)行拯救實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，與單獨(dú)的 Rack1 敲低相比，添加 doramapimod 和 2-HBA 導(dǎo)致細(xì)胞活力增加和相對 LDH 含量降低 （p < 0.05；圖 6H，I）。此外，在添加 doramapimod 和 2-HBA 后，細(xì)胞內(nèi)亞鐵離子濃度降低，同時(shí) ROS 和脂質(zhì)過氧化水平降低（p < 0.05；圖 6J-L）。這些發(fā)現(xiàn)表明，Rack1 通過P38信號通路和 Nqo1 調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鐵含量和脂質(zhì)過氧化，從而介導(dǎo)腸上皮細(xì)胞的鐵死亡。

研究總結(jié)

本研究利用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對 GDs 14-16 期間的正常和 ARM 大鼠胚胎樣本進(jìn)行測序。作者在后腸區(qū)域鑒定了具有高連接性的新樞紐基因，即?Rack1 、 Uba52 、 Tpt1 、 Npm1?和?Eef1b2。相比之下，作者觀察到 MAPK 信號通路的顯著富集和 Gpx4 在后腸區(qū)域的差異表達(dá)。值得注意的是，Rack1?在 GDs 15 和 16 的 ARM 后腸中表達(dá)降低，通過 P38/Nqo1/Gpx4 軸升高細(xì)胞內(nèi)鐵、ROS 和脂質(zhì)過氧化水平，最終誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞鐵死亡，并可能影響 ARM 后腸發(fā)育。這些發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)了作者對 ARM 發(fā)病機(jī)制的理解，并對推進(jìn) ARM 產(chǎn)前診斷和治療策略的研究具有重要意義。