Comprehensive genomic and phenotypic analyses reveal the genetic basis of fruit quality in litchi

研究背景

荔枝是東南亞一種重要的經(jīng)濟水果作物，以其獨特的風味和營養(yǎng)價值而聞名。荔枝起源于中國云南省，具有2000多年的栽培史，由于長期的自然選擇和在不同氣候及種植條件下的人工育種，孕育了豐富的種質(zhì)資源，可用于性狀持續(xù)的遺傳改良。至今已有許多工作是從表型性狀來研究和評估荔枝的多樣性，然而，相應的遺傳變異未被充分的挖掘利用，尤其是能夠代表大量遺傳信息的核心種質(zhì)，群體遺傳結(jié)構(gòu)不清晰，許多重要育種性狀如果實大小、風味、種子大小等調(diào)控果實品質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)仍有待深入探索。

研究內(nèi)容

該研究中對來自國家荔枝種質(zhì)資源圃（廣州）從全球收集的276份具有代表性荔枝種質(zhì)資源進行了重測序，測序深度20X，并鑒定出3450萬個高質(zhì)量的雙等位基因SNP，構(gòu)成了迄今為止荔枝（乃至整個無患子科）最全面的遺傳變異圖譜。

隨后，分析了群體結(jié)構(gòu)，在基因組水平上揭示了群體之間的遺傳變異水平和親緣關(guān)系，分析表明該群體內(nèi)存在四個主要亞群：YNG（云南亞群，來自云南野生、廣西大興的種質(zhì)）、HNG（海南亞群，來自海南和廣地博白的種質(zhì)）、FGG1, 和FGG2亞群（包含來自福建和部分廣東、廣西的種質(zhì)）。YNG的核苷酸多樣性低于HNG、FGG1和FGG2的，LD遺傳距離的大于其他三個亞群(圖1)。

圖1-荔枝群體結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性

通過對21個果實品質(zhì)相關(guān)性狀進行表型分析，發(fā)現(xiàn)果實性狀在許多方面表現(xiàn)出極大的多樣性，例如果實大小、種子大小、糖酸含量等方面。進一步并結(jié)合全基因組關(guān)聯(lián)研究，鑒定了總計460個與果實性狀顯著相關(guān)的SNP和1,807個候選基因，其中包含大量負責調(diào)控種子和果實品質(zhì)性狀的候選基因和基因組位點，并篩選出了幾個與種子早期發(fā)育相關(guān)的候選基因。特別是，利用高效液相色譜（HPLC）方法測定了190個荔枝品種果實的糖組分和含量，隨后，以蔗糖和葡萄糖的含量作為性狀進行GWAS分析，在7號染色體上檢測到一個強關(guān)聯(lián)峰這個關(guān)聯(lián)峰位于基因LITCHI009111（LcSAI）的基因體區(qū)域內(nèi)，該基因編碼β-果糖呋喃苷糖酶，也稱為轉(zhuǎn)化酶（invertase），該酶催化蔗糖分解為葡萄糖和果糖，并通過原核表達和轉(zhuǎn)基因等方法驗證了該基因的功能。通過比較LcSAI蔗糖和還原糖種質(zhì)中的差異，開發(fā)了一個與糖組分和含量緊密連鎖的分子標記，可用于荔枝育種的早期篩選，縮短育種周期。

圖2-荔枝果實性狀表型的多樣性

圖3-LcSAI 在荔枝果實的糖分積累中的作用

研究總結(jié)

綜上所述，該研究揭示了荔枝的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)，通過全面的基因組分析和表型分析，闡明了果實品質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)。這些發(fā)現(xiàn)為理解荔枝果實品質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)提供了寶貴資源和知識，為進一步的遺傳改良貢獻了理論基礎(chǔ)。

以上內(nèi)容來源于網(wǎng)絡，侵刪

辣椒（Capsicum annuum）是全球最早且廣泛栽培的蔬菜作物之一，其產(chǎn)生的包括辣椒紅素和辣椒素在內(nèi)的多種次生代謝產(chǎn)物在食品，醫(yī)療和軍工業(yè)都具有重要作用。一直以來，對于辣椒的改良主要依賴于傳統(tǒng)育種方法。相較于同為茄科作物的番茄，辣椒具有龐大而復雜的基因組，且其中超過80%為轉(zhuǎn)座子或重復序列。研究表明，轉(zhuǎn)座子和重復序列是轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的重要來源，由此暗示了辣椒基因組中含有豐富的順勢調(diào)控元件以及多樣的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式，而調(diào)控元件的變化是動植物進化和馴化的主要驅(qū)動力之一。

該研究以樟樹港辣椒為模型，系統(tǒng)揭示了辣椒在全基因組范圍內(nèi)的表觀特征，并在此基礎(chǔ)上推測包括啟動子和增強子在內(nèi)的瞬時調(diào)控元件。研究發(fā)現(xiàn)，辣椒啟動子主要由H3K4me3,?H3K27ac和開放染色質(zhì)共同修飾，而增強子的特征為開放染色質(zhì)。在此基礎(chǔ)上，該研究對生長發(fā)育以及脅迫響應的調(diào)控元件進行了挖掘，并對部分元件進行實驗驗證。此外，該研究報道了辣椒基因組基因間區(qū)H3K4me1和H3K27me3共同修飾的區(qū)域，推測為暫時未表達（poised）的調(diào)控元件，其具體分子功能有待驗證。

綜上，該研究系統(tǒng)挖掘辣椒基因組中重要的順勢調(diào)控元件，以及其調(diào)控的靶標基因，不僅為基因調(diào)控研究提供了基礎(chǔ)，也為通過靶向遺傳和表觀遺傳操作改良辣椒品種提供了理論支持。

以上內(nèi)容來源于北京大學現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院，侵刪

百邁客生物為該研究提供了SLAF-seq測序分析服務。

研究背景

油茶（Camellia oleifera Abel.）是我國重要的木本油料作物之一，以其高含油量與豐富的不飽和脂肪酸而享有“東方橄欖油”的美譽。我國已有超過2000年的油茶栽培歷史，并具有約4500萬畝的種植面積。油茶不僅具有經(jīng)濟價值，更具重要生態(tài)功能。其廣泛分布于我國南方多個氣候生態(tài)帶，是研究森林生態(tài)適應性與基因資源保護的重要對象。然而，當前油茶品種識別主要依賴形態(tài)學方法，容易造成品種混淆、資源管理混亂和知識產(chǎn)權(quán)糾紛等一系列問題，難以滿足現(xiàn)代林業(yè)種質(zhì)資源保護與良種選育的需求。為推動油茶良種選育，產(chǎn)業(yè)升級和響應國家森林四庫相關(guān)文件的精神，需加快構(gòu)建高效、廉價且準確的DNA指紋圖譜。

研究結(jié)果

1.用于SLAF測序的最優(yōu)限制性內(nèi)切酶組合

首先，研究共采集25個油茶栽培品種，共100個樣本,利用高通量SLAF-seq建庫策略進行數(shù)據(jù)獲取。在建庫酶切方案篩選方面，團隊預先開展酶切模擬試驗比較篩選最優(yōu)組合，F(xiàn)igure 1 顯示，RsaI + HaeIII組合在標簽分布均勻性、多態(tài)性與文庫復雜度上表現(xiàn)最佳。共獲得362,152個高質(zhì)量SLAF 標簽，其中254,357個為多態(tài)性標簽，平均GC含量41.30%，平均Q30高達93.44%，顯示測序數(shù)據(jù)具備極高的可靠性。RsaI + HaeIII雙酶切組合可實現(xiàn)高效的特異性位點擴增與標簽標準化，為后續(xù)大規(guī)模SNP檢測奠定了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

2.基因組變異特征分析

經(jīng)測序，每個樣本平均測序深度為13.95×，共鑒定出470,397個多態(tài)性SLAF標簽，并初步檢測到36,317,329個SNP位點，經(jīng)過質(zhì)控過濾后，最終保留了5,685,673個高質(zhì)量SNP供后續(xù)分析。這些SNP廣泛分布于油茶基因組的各個染色體區(qū)域，具有較強的代表性和應用潛力，為油茶的遺傳多樣性研究和分子育種提供了寶貴的遺傳資源。 Figure 2展示了SNP位點在各染色體上的分布密度、覆蓋深度和變異質(zhì)量參數(shù)，為后續(xù)的遺傳結(jié)構(gòu)分析及品種識別提供了堅實的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。

3.各油茶品種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

為了系統(tǒng)闡明25個油茶品種之間的親緣關(guān)系與遺傳結(jié)構(gòu)，研究結(jié)合了鄰接法（NJ樹）、主成分分析（PCA）與群體結(jié)構(gòu)分析（ADMIXTURE）三種方法，進行了系統(tǒng)發(fā)育與群體結(jié)構(gòu)分析（Figure 3）。NJ樹的結(jié)果顯示，大多數(shù)樣本能夠根據(jù)其品種進行合理聚類，呈現(xiàn)出明顯的系統(tǒng)發(fā)育規(guī)律。然而，部分品種則呈現(xiàn)出混合的聚類模式，具體包括華碩HS與華鑫HX、湘林XL-3與湘林XL-210、以及湘林XL-1與長林CL-4。而達林DL-22品種的個體聚類較為分散且無序，表現(xiàn)出較為復雜的遺傳結(jié)構(gòu)。在PCA分析中，前兩個主成分（PC1和PC2）解釋了大部分遺傳變異（PC1和PC2分別占11.20%和8.89%），并顯示出明顯的群體結(jié)構(gòu)分布，這與NJ樹的聚類結(jié)果高度一致。進一步的群體結(jié)構(gòu)分析表明，當K值為3時，分析結(jié)果最佳，將品種劃分為三大類群：第一類群包括達林DL-1、長林CL-4和湘林XL-1；第二類群包括川榮CR-153、湘林XL-3和湘林XL-210；第三類群則包括其余所有品種。需要注意的是，DL-22品種的個體表現(xiàn)出較高的遺傳混雜性，這可能與其基因漸滲、引種或雜交歷史相關(guān)。這些分析結(jié)果為進一步理解油茶品種的遺傳多樣性、進化關(guān)系以及品種改良提供了重要的遺傳信息。

4.遺傳多樣性揭示品種差異

為了全面評估油茶種質(zhì)資源的遺傳多樣性，研究統(tǒng)計了包括雜合度（Heterozygosity）、核苷酸多樣性指數(shù)（π）、單態(tài)位點數(shù)量（Singleton）以及Watterson’s θ值等關(guān)鍵遺傳參數(shù)（Figure 4）。結(jié)果表明，川榮（CR）系列品種（如CR-153、CR-55）在各項遺傳變異指標上均表現(xiàn)出較高水平，尤其是核苷酸多樣性指數(shù)（π）顯著高于其他品種。具體而言，singleton在長林（CL）系列品種（如CL-3、CL-4、CL-40）、翠屏（CP）系列（如CP-16）和江安（JA）系列品種（如JA-54）中較少，而在川榮CR-153和CR-55中則為最多（Figure 4B）。核苷酸多樣性（π）值的差異也較為顯著，川榮品種CR-50、CR-156、CR-55和CR-153的π值明顯高于其他品種，表明川榮系列品種具有較高的遺傳多樣性，可能為油茶品種改良和分子育種提供重要的遺傳資源（Figure 4C）。類似地，Wattersonθ分析進一步揭示了品種間分離位點的變化，川榮CR-153、湘林XL-3和CR-55表現(xiàn)出較高的θ值，與singleton的趨勢一致（Figure 4D）。近交系數(shù)（F）分析結(jié)果與遺傳多樣性模式一致，顯示川榮CR-156、CR-55和CR-447的F值最低，表明其遺傳多樣性較高，而長林CL系列品種（如CL-3、CL-40、CL-4）的F值較高，反映其遺傳多樣性較低。總體而言，遺傳多樣性分析結(jié)果表明，長林（CL）系列品種由于長期的人工選育和馴化，遺傳背景較為單一，表現(xiàn)出較低的遺傳多樣性；而川榮系列品種則保持較高的遺傳多樣性。該研究結(jié)果為篩選核心種質(zhì)資源和制定育種策略提供了有力的遺傳依據(jù)。

5.遺傳分化分析明確親緣結(jié)構(gòu)

通過計算品種兩兩之間的Fst值與構(gòu)建遺傳距離矩陣，研究進一步明確了油茶品種間的遺傳分化程度和親緣關(guān)系（Figure 5）。Fst值的分析結(jié)果顯示，長林CL-4、達林DL-1與湘林XL-1三者之間的Fst值極低（0.0106–0.0110），這表明這些品種可能源自相同或相似的遺傳背景。類似地，川榮CR-153與湘林XL-3、湘林XL-210之間的Fst值也表現(xiàn)出較高的遺傳相似性（0.0036–0.0442），提示這些品種可能具有共同的祖源關(guān)系。相比之下，達林DL-22與川榮CR-50（0.0816）、川榮CR-55（0.0870）和達林DL-1（0.0759）之間的Fst值較高，顯示出較為顯著的遺傳分化，反映其與這些品種的親緣關(guān)系較為緊密，但仍保持一定的遺傳獨特性。其它品種的Fst值范圍從0.1013到0.2908，表明這些品種的遺傳起源更加多樣，可能涉及不同的地理區(qū)域或品種間的較大差異（Figure 5A）。研究人員進一步使用GCTA軟件計算的G矩陣分析，結(jié)果顯示大多數(shù)油茶品種之間的親緣關(guān)系較為明顯，遺傳分化較大（Figure 5B）。然而，一些品種群體的親緣關(guān)系值相似，例如XL-1、CL-4與DL-1；CR-153、XL-3與XL-210；華碩HS與華鑫HX，表明這些品種可能源自相同或相近的祖先背景。與此不同，達林DL-22品種在其群體內(nèi)部未顯示出顯著的親緣關(guān)系，反映出其群體內(nèi)存在較高的遺傳分化?？傮w而言，這些分析為理解油茶品種的遺傳背景和親緣結(jié)構(gòu)提供了重要依據(jù)，揭示了不同品種之間的親緣關(guān)系及其遺傳多樣性。

6.構(gòu)建核心SNP指紋圖譜實現(xiàn)品種識別

為建立油茶品種的快速鑒定體系，研究人員進一步構(gòu)建了25個主栽油茶品種的DNA指紋圖譜（Figure 6）。在初步獲得的234個候選SNP中，有196個位點被注釋為功能明確的編碼區(qū)域突變，富集于DNA連接、RNA加工、果糖代謝等重要通路（Figure 6A）。為提升區(qū)分效率，進一步篩除掉存在多變異干擾或功能不明的位點，最終篩選得到15個核心SNP位點，可有效區(qū)分全部25個油茶品種，實現(xiàn)穩(wěn)定的遺傳身份標識。為確保指紋圖譜的準確性與應用價值，研究通過Sanger測序?qū)?5個候選SNP位點進行了引物驗證，最終篩選出8個多態(tài)性強、峰型清晰的核心SNP位點用于構(gòu)建指紋圖譜（Figure 6B）。這些位點主要分布于功能基因區(qū)，涉及次生代謝、胚胎發(fā)育、自噬調(diào)控等關(guān)鍵生物過程，如編碼α-萜品醇合酶的LG12_G02320和控制胚胎發(fā)育與芽形成的FLA8蛋白基因LG03_G02445等，展現(xiàn)出良好的應用潛力。為進一步提升指紋信息的實用性，研究人員還開發(fā)了包含8個位點基因型信息的二維碼系統(tǒng)，其中涵蓋了油脂品質(zhì)、農(nóng)藝性狀及適宜種植區(qū)域等數(shù)據(jù)，為油茶品種的數(shù)字化管理與選育決策提供便捷、高效的技術(shù)支持（Figure 6C）。二維碼系統(tǒng)為油茶品種的數(shù)字化管理與選育決策提供了便捷、高效的技術(shù)支持。通過將分子標記信息與油茶生產(chǎn)應用相結(jié)合，研究成果不僅實現(xiàn)了分類識別功能，還為分子育種提供了重要參考價值。

總結(jié)

綜上，該DNA指紋圖譜的構(gòu)建為油茶種質(zhì)資源的快速鑒定、精準管理及產(chǎn)業(yè)化育種提供了高效工具和理論依據(jù)。其開發(fā)的二維碼系統(tǒng)進一步推動了油茶品種管理的智能化和數(shù)據(jù)化，為我國油茶資源保護、優(yōu)質(zhì)品種選育及區(qū)域性產(chǎn)業(yè)布局提供了科學支持。

內(nèi)容來源于林木科學評論 侵刪

百邁客生物為該研究提供群體、轉(zhuǎn)錄組測序服務。

研究背景

高粱是世界第五大禾谷類作物，養(yǎng)活了世界干旱或半干旱地區(qū)5億多人口。高粱起源于非洲薩赫勒地區(qū)，對非生物脅迫，比如干旱、高溫、貧瘠、鹽堿等有良好的耐受性，是研究植物響應逆境脅迫機制的理想模式物種。然而，有限的遺傳和基因組資源以及遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的瓶頸限制了高粱功能基因的研究。

研究內(nèi)容

研究團隊利用ONT Ultra-long、PacBio HiFi和Hi-C技術(shù)，成功組裝了高粱E048 的T2T無缺口高質(zhì)量基因組圖譜。該基因組大小為729.5 Mb，預測蛋白編碼基因35,549個，并完整解析了全部端粒和著絲粒序列信息。通過與BTx623、Ji2055、HYZ等另外3個高粱T2T基因組的比較分析，研究團隊鑒定出E048特異存在的2.9 Mb基因組區(qū)域，包含187個基因。這些基因主要參與信號轉(zhuǎn)導、免疫響應和代謝調(diào)控等生物學過程，為解析E048高抗病、抗逆、抗倒伏和高含糖量等優(yōu)異性狀的分子機制提供了重要線索。

為了深入解析高粱E048的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程，研究團隊測定了E048在13個不同發(fā)育階段多種組織（包括幼苗、葉片、根、莖、花序和種子等）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，構(gòu)建了全面的基因表達參考圖譜。分析表明，E048基因組中93.39%（33,200個）的基因在至少一種組織中表達，20,475個基因（57.59%）在所有13種組織中均檢測到表達。其中在開花前的花序組織中特異表達的基因數(shù)量最多，GO富集分析發(fā)現(xiàn)些特異表達基因主要參與生殖相關(guān)的生物學過程，反映了高粱從營養(yǎng)生長階段向生殖生長階段過渡時的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄特征。

研究團隊進一步開發(fā)了E048大規(guī)模飽和EMS突變體庫，在M1代收獲了13,226個單株并對179個M2植株進行了全基因組重測序。對變異位點進行分析發(fā)現(xiàn)，突變體包含了2,291,074個SNPs或InDels變異，突變位點幾乎均勻分布在每條染色體上，涵蓋了97.54%的基因，這些突變體為高粱功能基因解析與遺傳改良提供了重要種質(zhì)資源。研究團隊利用E048基因組，通過MutMap和MapMap+的方法，快速定位了黃化突變體和多葉突變體的目的基因，驗證了利用E048基因組和突變體資源進行高粱功能基因研究的高效性。

為促進高粱功能基因組研究以及突變體庫的廣泛應用，研究團隊還建立了高粱基因組和突變體庫數(shù)據(jù)庫SGMD（https://sorghum.genetics.ac.cn/SGMD）。該數(shù)據(jù)庫整合了高粱E048基因組信息、基因表達圖譜、突變體庫部分表型變異和基因變異信息等，是高粱功能基因研究的“超級工具包”。

內(nèi)容來源于MPlant植物科學，侵刪

以下小編列舉三篇成功案例，解析群體在QTL定位中的應用。

當我們針對一群體，關(guān)注性狀較多時，可參照案例一，整篇文章通過群體圖譜構(gòu)建，QTL定位后幾乎沒有驗證工作，可以幫我們拿到一個群體QTL的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

案例一

發(fā)表期刊：Plant Physiology and Biochemistry

影響因子：6.1

合作單位：江蘇省徐淮區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部甘薯生物學與遺傳改良重點實驗室

實驗方法：Xin24×Yushu10雜交中選擇212個F1材料: 特異性位點擴增片段測序（SLAF-seq）；遺傳圖譜構(gòu)建；數(shù)量性狀位點（QTL）定位；GWAS關(guān)聯(lián)（F1群體）

表型檢測：多年多表型收集

百邁客生物為該研究提供了群體測序及部分數(shù)據(jù)分析服務。

甘薯作為一個全球重要的作物，其含有豐富的營養(yǎng)成分以及對不同環(huán)境的適應能力。然而，由于其自交不親和，高雜合度等特性，使其遺傳特征的研究相對較少。作者從Xin24×Yushu10雜交中選擇212個F1材料，SLAF-seq測序，獲得親本26.73×，子代52.25×的測序數(shù)據(jù)，依據(jù)SNP及百邁客生物自主研發(fā)的HighMap構(gòu)圖軟件，生成一個長度為2441.56 cM、平均圖距為0.51 cM的遺傳圖譜。

基于連鎖圖譜，鑒定出26個QTL，解釋了6.3-10%的表型變異，包括6個最長藤蔓長度 QTL、6個單株產(chǎn)量 QTL、10個干物質(zhì)含量QTL、1個淀粉含量 QTL、一個可溶性糖含量QTL和2個類胡蘿卜素含量QTL。該研究結(jié)果對甘薯的標記輔助育種和基因克隆具有重要意義。

圖1-表型檢測

圖2-遺傳圖譜構(gòu)建

圖3-QTL定位

前文是對多個性狀的連鎖分析，當我們關(guān)注單個性狀時，BSA無疑是高性價比的初定位選擇，當然，這就意味著我們得做到基因的精細定位與克隆，除去傳統(tǒng)圖位克隆的方式，轉(zhuǎn)錄組，蛋白組，自然群體GWAS，基因組都可助力基因克隆，如果想發(fā)高水平的文章，基因的功能探索也是必不可少的。

成功案例二

發(fā)表期刊：Plant Biotechnology Journal

影響因子：10.1

發(fā)表單位：河南農(nóng)業(yè)大學

實驗方法：莢果大小/重量差異顯著2份Virginia-type花生材料( ND _ L和ND _ S)雜交，產(chǎn)生遺傳群體；F2:3群體BSA-seq（20+20混池）；F6:7 和F6:8群體精細定位；基因克??；系統(tǒng)進化分析；亞細胞定位；免疫熒光；酵母雙雜交；pull-down；CO-IP；番茄擬南芥轉(zhuǎn)化實驗等。

百邁客生物為該研究提供了群體測序及部分數(shù)據(jù)分析服務。

花生莢果大小是決定花生產(chǎn)量的關(guān)鍵農(nóng)藝性狀，為了鑒定控制花生莢果大小的基因，該研究對188份核心種質(zhì)進行鑒定，并選取莢果大小/重量差異顯著的2份花生材料構(gòu)建F2群體，BSA-Seq獲得了288.58 Gb的原始數(shù)據(jù)。利用285914個高質(zhì)量SNPs 和70 759個 InDel，將控制莢果大小的基因定位在07染色體1.17 Mb的區(qū)間內(nèi)。作者從F6：7和F6：8群體中開發(fā)了15個多態(tài)性標記并對個體進行基因分型，精細定位QTL到KASP 9 和In Del15之間20.4 kb的區(qū)間內(nèi)。該區(qū)間僅包含1個預測的非同義突變基因和InDels，將該基因命名為PSW1。

PSW1編碼一個LRR – RLK蛋白激酶，等位基因PSW1HapII賦予了PSW1更高的表達水平和對其輔助受體AhBAK1更強的親和力，以上調(diào)PSW1 – based途徑，調(diào)節(jié)花生莢果大小。此外，PSW1HapII的過表達增加了多種植物的種子/果實大小。

圖4-表型檢測

圖5-BSA分析

當然，如果想讓我們的文章影響因子再上一臺階，兼顧群體的“廣度”和“深度”，是更好的選擇。

成功案例三

發(fā)表期刊：Nature?Genetics

影響因子：30.8

發(fā)表單位：浙江省農(nóng)業(yè)科學院等

實驗方法：菜用豇豆G98，糧用豇豆G323 基因組Denovo；重測序GWAS：344份全世界收集的豇豆核心種質(zhì)，其中包括342份栽培豇豆（87份糧用豇豆、244份菜用豇豆和11份未知用途豇豆）和2份野生豇豆；Illumina測序，10x深度；基因單倍型驗證：菜用豇豆地方品種 ‘ZN016’ 和菜用豇豆育成品種‘Zhijiang282構(gòu)建的RIL群體（183 lines）G98和G323構(gòu)建的F2群體（165 individuals）

百邁客生物為該研究提供了群體測序、基因組測序及部分數(shù)據(jù)分析服務。

豇豆起源于非洲，在世界范圍內(nèi)作為糧食、蔬菜或牲畜飼料種植。該研究結(jié)合PacBio、Hi-C和二代測序，組裝了糧用豇豆和菜用豇豆的染色體水平基因組。對包括地方品種、野生品種和育成品種的344個材料進行二代測序，以闡明豇豆基因組的系統(tǒng)進化。

為了研究自然或人工選擇對豇豆分化的影響，作者通過選擇清除分析比較了三個豇豆亞群之間的基因組選擇特征，鑒定出239個與豇豆馴化和改良相關(guān)的基因。此外，通過GWAS，挖掘到裂莢性、莢長、單莢粒數(shù)、千粒重、可溶性糖、總淀粉和粗蛋白質(zhì)含量相關(guān)基因，并在遺傳群體中驗證。同時揭示了兩個亞種之間基因組結(jié)構(gòu)變異（SVs）的全圖譜，為豇豆在全基因組選擇下的馴化與改良提供了見解。產(chǎn)量性狀和品質(zhì)性狀的差異基因組選擇將有助于建立糧用豇豆和菜用豇豆雙向改良的遺傳資源。

圖6-群體選擇與GWAS分析

今日分享結(jié)束，期待下期精彩內(nèi)容~~~

發(fā)表期刊：Poultry Science

影響因子：3.8

發(fā)表單位：南京農(nóng)業(yè)大學，西藏農(nóng)牧學院等

研究對象：金陵白鴨

研究方法：全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）

百邁客生物為該研究提供了全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）測序及部分數(shù)據(jù)分析服務。

研究背景

鴨子為人類消費提供肉、蛋、羽毛等產(chǎn)品，中國是世界上最大的鴨肉消費國。金陵白鴨做為我國優(yōu)質(zhì)的選育品種，具有優(yōu)良的生長速度和肉質(zhì)品質(zhì)。從孵化到上市的整個時期，鴨子的體重逐漸增加，這一過程由復雜的生理和生化機制調(diào)控，器官和骨骼的發(fā)育是體重增加的關(guān)鍵因素，全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）是許多牲畜和家禽物種研究生長和發(fā)育的遺傳機制的常用方法，然而，現(xiàn)有的一些關(guān)于鴨生長發(fā)育性狀的GWAS研究測序深度較低，發(fā)現(xiàn)的候選基因很少。

材料方法

201只雄鴨全基因組測序深度為10×；

GWAS分析：表型：出生體重（BWB）、1周體重（BW1）、3周體重（BW3）、5周體重（BW5）和7周體重（BW7）分析模型：FaST-LMM；EMMAX；LMM；LM 閾值線：log10(p)=5如果一個SNP在2個或更多的模型中被關(guān)聯(lián)，作者認為它是一個與特定性狀相關(guān)的高可信度SNP。

進化分析：進化樹構(gòu)建；群體結(jié)構(gòu)分析；PCA分析；LD衰減分析等

研究結(jié)果

1.金陵白鴨群體體重表型統(tǒng)計

該研究對金陵白鴨（n = 201）在不同時期的體重進行統(tǒng)計，BWB、BW1、BW3、BW5和BW7的體重均值分別為46.93g、127.19g、697.17g、1182.43g和1,888.52g。生長曲線結(jié)果顯示：金陵白鴨第3周-第5周生長最快，第5周后生長放緩。體重的分散度隨著年齡和體重的增加而增加。相鄰2周的體重之間存在較強的相關(guān)性，BW3與BW1（r = 0.6）、BW5（r = 0.68）和BW7（r = 0.6）顯著正相關(guān)，BW5與BW7顯著正相關(guān)（r = 0.82）。但隨著時間間隔的延長，性狀間的相關(guān)性降低，BW1與BW7的相關(guān)性不顯著（r = 0.21），BWB則與BW3 (r = 0.18)， BW5 (r = 0.058)，BW7 (r = 0.45)均不顯著相關(guān)。

圖1-表型分析

2.金陵白鴨系統(tǒng)發(fā)育、群體遺傳結(jié)構(gòu)解析

雖然該研究只有金陵白鴨一個種群，但考慮到繁殖過程中種群分層的潛力，作者進行了系統(tǒng)發(fā)育和群體結(jié)構(gòu)分析。系統(tǒng)發(fā)育樹和PCA結(jié)果顯示，金陵白鴨可分為5個種群，群體結(jié)構(gòu)表明，當K=6時分群結(jié)果最佳，金陵白鴨種群具有豐富的遺傳多樣性，總SNPs的平均R2為0.24，當R2=0.2，LD的衰減距離約為30kbp。

圖2-群體進化分析

3.GWAS分析

該研究對基于測序產(chǎn)生的2,610.50 Gbp的clean data進行分析，Q30為95.55%，樣本與參考基因組平均比對率為99.59%，平均覆蓋深度為10×，基因組覆蓋度為96.51%。作者利用，797,309,337個SNPs，4種關(guān)聯(lián)模型進行后續(xù)GWAS分析，其中95個SNP與BWB性狀顯著相關(guān)，這些SNP主要分布在1號染色體和4號染色體上。通過篩選和注釋，共檢測到5個相關(guān)的候選基因：PUS7、FBXO11、FOXN2、MSH6、SLC4A4。針對BW1性狀，作者發(fā)現(xiàn)了101個與BW1性狀顯著相關(guān)的SNPs，這些SNP主要分布在7號染色體上，共檢測到2個與BW1性狀相關(guān)的候選基因：RAG2和TMEFF2。針對BW3性狀，作者發(fā)現(xiàn)了112個顯著SNPs。這些SNP主要分布在1號染色體和11號染色體上。通過篩選和注釋，共檢測到4個與BW3性狀相關(guān)的候選基因：?STARD13、Klotho、ZAR1L和TLE3。同時確定了92個與BW5性狀相關(guān)SNPs，這些SNP主要分布在1號染色體和2號染色體上，通過注釋STARD13、Klotho和ZAR1L與BW5性狀相關(guān)。此外，作者還鑒定了新的候選基因：KAT2B、KCNH8和SATB1。

BW7性狀與33個SNP關(guān)聯(lián)，這些SNP主要分布在1號染色體和2號染色體上。通過篩選和注釋，共檢測到6個與BW7性狀相關(guān)的候選基因：PLXNC1、ATP1A1、CD58、FRYL、OCIAD1和OCIAD2。在分析的四個模型的結(jié)果，LM識別出了更多的顯著位點，曼哈頓圖顯示出更高的峰值。然而，QQ-plot顯示，LM模型中的大部分站點都位于對角線上方，可能具有較高的假陽性。其余3個模型的結(jié)果均表現(xiàn)出一致性，而QQ-plot的結(jié)果則優(yōu)于LM模型。

圖3-GWAS分析

研究總結(jié)

金陵白鴨是一種新開發(fā)的品種，因其生長速度快，肉質(zhì)優(yōu)良的特點，使其具有重要的經(jīng)濟價值和研究潛力；然而，人們對其體重性狀的遺傳基礎(chǔ)尚不太清楚。該研究對201只金陵白公鴨進行了全基因組重測序，并進行了群體基因組分析，表明金陵白鴨種群具有豐富的遺傳多樣性。

作者對出生體重（BWB）、1周體重（BW1）、3周體重（BW3）、5周體重（BW5）和7周體重（BW7）進行了全基因組關(guān)聯(lián)分析，4種統(tǒng)計模型比較研究表明，F(xiàn)aST-LMM表現(xiàn)出最優(yōu)的效率，產(chǎn)生更多的結(jié)果和最小的假陽性。

作者發(fā)現(xiàn)，PUS7、FBXO11、FOXN2、MSH6和SLC4A4均與BWB相關(guān)。RAG2和TMEFF2是BW1的候選基因，STARD13、Klotho、ZAR1L可能是BW3和BW5的候選基因。PLXNC1、ATP1A1、CD58、FRYL、OCIAD1和OCIAD2與BW7相關(guān)。這些研究結(jié)果為金陵白鴨的選擇和育種提供了遺傳參考，同時也加深研究者們對白鴨生長發(fā)育表型的認識。

沈陽醫(yī)學院高兵教授團隊在?Redox Biology?雜志發(fā)表題為“ Meta-data analysis of kidney stone disease highlights?ATP1A1?involvement in renal crystal formation ”?的研究論文，結(jié)合全外顯子測序與轉(zhuǎn)錄組等組學數(shù)據(jù)分析，解釋ATP1A1在腎晶體形成中起到的重要作用，表明ATP1A1可能是治療鈣結(jié)石的潛在治療靶點。ong>

英文標題：Meta-data analysis of kidney stone disease highlights?ATP1A1?involvement in renal crystal formation

中文標題：腎結(jié)石病的Meta數(shù)據(jù)分析揭示ATP1A1參與腎晶體形成

發(fā)表期刊：Redox Biology

合作單位：沈陽醫(yī)學院

影響因子：10.7

研究對象：CaOx腎結(jié)石患者及對照組樣本

研究方法：全外顯子測序（WES）+表達譜數(shù)據(jù)分析

百邁客生物為該研究提供了外顯子測序服務。

研究背景

腎結(jié)石在全球范圍內(nèi)都威脅著人類的生命健康，近年來發(fā)病率和復發(fā)率都不斷上升，大多數(shù)腎結(jié)石由草酸鈣（Calcium ox）結(jié)石組成，晶體-細胞粘附被認為是晶體保留和結(jié)石形成中的關(guān)鍵步驟，有研究報道，受損的腎小管上皮細胞對晶體附著的親和力增加，而晶體沉積通過產(chǎn)生過多的活性氧（ROS）反過來又誘導細胞損傷和炎癥反應。Na/K-ATPase（NKA）是一種在腎臟中高度表達的跨膜離子泵，同時其由ATP1A1編碼的α1亞基也起到信號轉(zhuǎn)導器的作用，當?ATP1A1?構(gòu)象改變或被敲低時，Src 就會被磷酸化并激活下游信號級聯(lián)，進而導致 ROS 的產(chǎn)生，ROS可以激活MAPK級聯(lián)反應和NF-κB炎癥反應，并作為ATP1A1的配體啟動ATP1A1/Src信號通路，從而形成NKA/ROS擴增環(huán)，誘導氧化應激，然而，ATP1A1在腎結(jié)石形成中的作用尚不清楚。本實驗結(jié)合多組學分析方法，以期提供一種有用的方法，研究腎結(jié)石形成病理。

材料方法

實驗材料：28例中國漢族CaOx腎結(jié)石患者及對照組樣本

組學方法：全外顯子測序（WES）+表達譜數(shù)據(jù)分析

研究結(jié)果

首先該研究從GEO數(shù)據(jù)中獲取了腎臟鈣結(jié)石患者的表達譜數(shù)據(jù)化，其中患者的RP組織（Randall斑塊）命名為P組，患者的正常組織命名為N組，對其表達譜篩選基因進行WGCNA分析，選擇與樣本相關(guān)性較高的淺橙色模塊（434個基因）進行后續(xù)研究，GO富集結(jié)果表明這些基因在質(zhì)膜和跨膜轉(zhuǎn)運中富集。KEGG富集分析顯示，這些基因參與“醛固酮調(diào)節(jié)的鈉重吸收”、“礦物質(zhì)吸收”、“內(nèi)分泌等因子調(diào)節(jié)的鈣重吸收”和“近端小管碳酸氫鹽回收”等通路，進一步查看發(fā)現(xiàn)，FXYD2、FXYD4、ATP1A4、ATP1A1和ATP1B1等5個編碼NKA的基因參與了跨膜轉(zhuǎn)運、吸收和重吸收的過程，表明NKA可能與腎結(jié)石密切相關(guān)。

為進一步探究腎結(jié)石相關(guān)關(guān)鍵基因，該研究對28例中國漢族CaOx結(jié)石患者進行了WES分析，共鑒定得到76個SNPs，其中錯義SNPs31個，編碼同義SNPs30個，3′UTR7個SNPs，5′UTR區(qū)8個SNPs，作為候選SNPs，這些突變位點定位于67個基因，將這67個基因與WGCNA分析中的434個基因做韋恩圖取交集，發(fā)現(xiàn)ATP1A1是兩個數(shù)據(jù)集交叉點中的唯一基因，一定程度上說明了ATP1A1在鈣結(jié)石形成中的潛在作用。

接下來，該研究從WES數(shù)據(jù)中提取了ATP1A1的SNP，rs11540947 T等位基因在患者組中的突變頻率頻率為16.1%，而對照組僅為2.4%。為進一步證實rs11540947與鈣結(jié)石形成的相關(guān)性，收集214例鈣結(jié)石患者和232例匹配對照，通過HRM分析檢測rs11540947的基因型，結(jié)果顯示，CT+TT攜帶者在患者中比對照組更常見，且在男性中與鈣結(jié)石有關(guān)，但在女性中無顯著相關(guān)性，SNPrs11540947 （NM_000701:c.-78C > T）位于?ATP1A1?的 5′UTR 中；在ATP1A1的5′UTR中發(fā)現(xiàn)了Sp1結(jié)合位點和潛在的TATA盒，表明5′UTR具有啟動子活性，雙熒光素酶報告基因結(jié)果也證明了這一點，rs11540947的T等位基因介導了ATP1A1啟動子活性的顯著降低，這可能會降低ATP1A1在轉(zhuǎn)錄水平的表達。對草酸鈣一水合物（COM）暴露處理的HK2細胞（人腎近曲小管上皮細胞）進行指標測定，結(jié)果顯示處理3h后，NKA酶活性和ATP1A1 mRNA水平顯著下降，6h后ATP1A1的蛋白水平升高，隨后降低，同時COM 暴露后細胞內(nèi) ROS 水平顯著增加，這可能與ATP1A1/Src信號通路的激活有關(guān)，而ATP1A1的過表達抑制了COM誘導的Src、p38、JNK、p65和p50激活；WB結(jié)果也顯示COM激活的半胱天冬酶3被ATP1A1的過表達以及ATP1A1/Src信號復合物的特異性拮抗劑pNaKtide顯著抑制，從而阻斷了細胞凋亡過程。

晶體與細胞的粘附是結(jié)石形成的關(guān)鍵過程，晶體沉積會損傷腎細胞，因此，作者研究了ATP1A1在晶體-細胞粘附中的作用。該研究觀察到用 Ad-hATP1A1 感染和用 pNaKtide 處理后，Ca²⁺濃度與對照組相比顯著降低，表明ATP1A1過表達和pNaKtide可以阻止晶體與細胞的粘附，從而保護細胞免受CaOx晶體誘導的損傷并減少腎結(jié)石的形成。DNA啟動子中CpG島的甲基化是基因沉默的常見機制，COM暴露后，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的mRNA和蛋白質(zhì)水平均顯著升高，而用DNA甲基化抑制劑5Aza-2dc預處理HK2細胞再進行COM暴露處理后，ATP1A1表達量下調(diào)；ATP1A1的蛋白水平也被逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果表明，改變的DNA甲基化參與了COM誘導的ATP1A1降低。

為了證實ATP1A1對體內(nèi)晶體形成的影響，該研究構(gòu)建了CaOx腎病大鼠模型，用 pNaKtide 治療后尿草酸鹽排泄量顯著減少，與體外研究結(jié)果類似，HYP+CaCl2處理降低了 ATP1A1 mRNA和蛋白質(zhì)表達水平，激活了 Src、p38、JNK、p65 和 p50，降低 Nrf2 表達，而這些均被pNaKtide逆轉(zhuǎn)，這些結(jié)果強調(diào)了ATP1A1和ATP1A1/Src信號通路在腎結(jié)石形成中的重要性。

研究總結(jié)

綜上所述，該研究從遺傳水平和環(huán)境因子影響的轉(zhuǎn)錄水平探究腎結(jié)石相關(guān)關(guān)鍵易感基因，將鈣結(jié)石形成者Randall斑塊（RP）組織的基因表達譜數(shù)據(jù)與CaOx患者的WES數(shù)據(jù)相結(jié)合，鑒定出ATP1A1這一關(guān)鍵基因，還研究了ATP1A1遺傳變異與鈣結(jié)石風險的關(guān)聯(lián)，并進一步探討了ATP1A1/Src/ROS信號在體外和體內(nèi)腎結(jié)石形成中的作用，這項研究的發(fā)現(xiàn)揭示了ATP1A1基因變異及其表達降低參與腎晶體形成的機制，可能為CaOx結(jié)石提供潛在的治療靶點。

參考文獻：

Li Y, Lu X, Yu Z, Wang H, Gao B. Meta-data analysis of kidney stone disease highlights?ATP1A1?involvement in renal crystal formation.?Redox Biol. 2023 May;61:102648. doi: 10.1016/j.redox.2023.102648. Epub 2023 Feb 27. PMID:36871182.

該研究以瓢雞和仙居雞為親本建立回交家系，以探索瓢雞無尾特征的遺傳機制和分子基礎(chǔ)。通過全基因組關(guān)聯(lián)和連鎖分析，研究人員將無尾性狀的候選區(qū)域精確定位到798.5 kb的區(qū)間內(nèi)（chr2:86.9-87.7 Mb）。

通過對包含家系內(nèi)特殊基因型個體的突變位點進行綜合篩選和分析后，一個4.2 kb的缺失被確定與瓢雞的無尾表型完全相關(guān)。在對致因區(qū)間內(nèi)的基因表達結(jié)果進行深入探究后，一個全新的基因Rum（長度大于22 kb，無內(nèi)含子），其表達呈現(xiàn)出無尾表達缺失，雜合子是顯性純合子表達量的一半的現(xiàn)象。深入研究發(fā)現(xiàn)Rum的表達具有胚胎特異性，研究人員認為Rum的表達缺失以及雜合子中的單倍劑量不足，使其無法正常調(diào)控MSGN1基因長轉(zhuǎn)錄本以及TBX6等基因的正常表達，進而使得尾部骨骼發(fā)育出現(xiàn)異常。

瓢雞無尾表型的定位區(qū)間，與之前報道的美國阿勞卡納雞品種無尾表型區(qū)間非常接近但精細定位區(qū)間沒有重疊。對瓢雞、阿勞卡納以及其他具有正常尾巴的多個種群的群體基因組分析顯示，雖然這兩個無尾品種在2號染色體的相同區(qū)域受到選擇，但選擇具有品種差異性。在阿勞卡納雞2號染色體上識別的兩個候選SNP在無尾瓢雞中并不存在，并且在瓢雞中證實的致因缺失突變在阿勞卡納雞也不存在。即瓢雞和阿勞卡納雞無尾特征可能源自不同的致病突變。

值得注意的是，阿勞卡納和瓢雞是遺傳上獨特的品種，兩者沒有共同祖先。瓢雞源自中國云南，阿勞卡納起源于智利后引入美國。兩種無尾雞在外觀表型上也有所不同，包括體型、耳簇和蛋殼顏色等。在當前的研究中，確認了這兩個品種特有的致因突變存在。因此，如果這些不同的遺傳背景導致了相同的表型，這意味著自然已經(jīng)進化出了替代的遺傳解決方案來實現(xiàn)所需的表型特征。這種遺傳路徑的冗余匯聚形成了共同的表型，是進化多樣性的顯著例證。

研究發(fā)現(xiàn)了瓢雞無尾的致因突變和關(guān)鍵基因，揭示了關(guān)鍵基因的作用方式。這項研究不僅增進了我們對于雞骨骼發(fā)育調(diào)控的理解。還強調(diào)了遺傳演化和適應性的動態(tài)本質(zhì)，是鳥類遺傳和進化研究領(lǐng)域的又一突破性的發(fā)現(xiàn)。

 

期刊：Nature Genetics

IF：30.8

時間：2023年 7月

全文：點擊下載

作者通過秈稻品種特青和粳稻品種02428構(gòu)建高級遺傳群體克隆了產(chǎn)量相關(guān)基因GY3，其啟動子區(qū)域的反轉(zhuǎn)座子插入增強了啟動子區(qū)域的表觀修飾，降低GY3表達量，從而減少細胞分裂素合成前體底物的無效消耗，提高體內(nèi)活性的細胞分裂素含量，增加每穗粒數(shù)和谷物產(chǎn)量。GY3可作為后期秈稻高產(chǎn)育種的重要目標基因，推動產(chǎn)量提升。

野生八倍體草莓單倍型基因組解析

期刊：Nature Plants

IF：18.0

時間：2023年7月

全文：點擊下載

該研究報道了兩個八倍體野生草莓智利草莓 (F. chiloensis)和弗州草莓 (F. virginiana)染色體水平的高質(zhì)量分型基因組組裝。探討了八倍體草莓在馴化過程中的同源偏向性表達分化，并鑒定到了一些重要的轉(zhuǎn)錄因子在馴化過程中發(fā)生了表達轉(zhuǎn)變。此研究深度解析了草莓的起源、基因組進化和馴化。（百邁客參與測序工作·）

橡膠樹基因組解析助力馴化研究

期刊：Nature Communications

IF：16.6

時間：2023年7月

全文：點擊下載

作者利用PacBio CLR＋BioNano＋Hi-C的方法構(gòu)建了橡膠樹參考基因組，結(jié)合127個栽培和208個野生品種重測序數(shù)據(jù)對其馴化的分子機制解析，同時通過208份橡膠樹種質(zhì)材料進行GWAS分析，鑒定到一個調(diào)控乳管數(shù)量的馴化基因。此研究將為后期橡膠樹的高產(chǎn)育種提供了分子基礎(chǔ)。

被子植物6大器官模式圖

1、在與研究目的不沖突的前提下，盡量選取新鮮、幼嫩、生長狀態(tài)良好的組織部位。植物組織越幼嫩新鮮所含的次生代謝產(chǎn)物就越少，隨著植物組織的逐漸成熟，次生代謝產(chǎn)物的含量會逐漸增多，而次生代謝產(chǎn)物的存在會影響核酸的提取效果，次生代謝產(chǎn)物越多，核酸提取越困難，得率也越低。

2、如果植物組織表面污漬較多，在采集之前應迅速用預冷的純凈水或75%乙醇擦拭或沖洗干凈，再用吸水紙吸干組織表面殘留液體。

3、將處理好的組織樣本混合均勻后保存于2 mL或更大體積的旋蓋凍存管中。

4、建議10min中內(nèi)（越快越好）置于液氮中冷凍1h以上，然后轉(zhuǎn)移至-80℃長期保存，干冰運輸。

1）提前準備好冷凍組織的足量液氮，預裝樣品的凍存管，并在做好標記（盡量不使用漢字命名，命名字符控制在5個以內(nèi)）

2）活體取下新鮮組織，立即剔除結(jié)締組織等非研究所需的組織類型。對腫瘤組織的取材，應盡可能準確地判定腫瘤和正常組織，腫瘤組織應將周圍的正常組織切除干凈（正常組織也應周圍的腫瘤組織切除干凈），腸道組織一定要把內(nèi)容物清洗干凈；

3）迅速用預冷的PBS溶液（RNase free）或0.9%生理鹽水將組織表面的殘留血液沖洗干凈

4）如果組織體積較大，將組織切成長寬高均≤0.5 mm 的小塊（即黃豆大小）

5）將凍處理好的組織樣本混合均勻后保存于2 mL 或更大體積的螺口凍存管（RNase free）中，標注編號。

6）立即（20s內(nèi)）置于液氮中冷凍 3~4 h，然后轉(zhuǎn)移至-80 °C長期保存

7）干冰運輸。

2）震蕩混勻，常溫裂解 5 min 后，使用低溫離心機12000g離心10min，將上清液轉(zhuǎn)至新的2.0ml離心管中（拍質(zhì)控照片，方便核查），轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，運輸時選擇干冰寄送。

2）如果組織帶血液或其他體液，需要過夜后更換一次RNAlater??Solution；不要將剛浸入RNAlater Solution中的樣本立即冷凍，需將樣本置于4 °C 保存過夜（使Solution充分浸潤組織樣本），然后轉(zhuǎn)移至-20 °C 或-80 °C 長期保存；

3）RNAlater??Solution 不會影響組織結(jié)構(gòu)，可以把已保存的組織從 RNAlater??Solution中取出，切下實驗所需的用量，把剩余的組織再放入到原來的保存液中繼續(xù)保存；

4）保存于RNAlater??Solution中樣本，-20 °C 存放時，樣本不會結(jié)凍，但可能會有晶體析出，這并不影響后續(xù)的 RNA 提取工作；-80 °C 存放時，樣本會結(jié)凍， 在進行 RNA 提取前，需置于冰上融化再進行后續(xù)操作，解凍后的樣本可再次放入-80 °C 保存；

5）一般來講，生物樣本保存于RNAlater??Solution中，37 °C可存放1天，25 °C（室溫）可存放1周，4 °C 可存放1個月，-20 °C 或-80 °C 可長期保存。但鑒于生物樣本的特殊性及實驗可重復性，建議所有保存于RNAlater??Solution中樣本，都要置于-20 °C 或-80 °C 長期保存。

1）顯微鏡下觀察細菌生長狀態(tài)，盡量收集生長期處于對數(shù)期的細菌。

2）將適量體積的菌液轉(zhuǎn)移至2 mL 旋蓋尖底離心管（無菌，無核酸酶）中，于室溫下14000 ×g 離心1 min。

3）棄掉培養(yǎng)基，將細菌菌體沉淀迅速置于液氮中冷凍1-3 h以上（凍存時間視組織量而定，保證樣品凍存充分），然后轉(zhuǎn)移至-80 °C長期保存。

4）將樣品管置于管架上固定好后埋在干冰箱的中間部位，大體積干冰運輸。

1）顯微鏡下觀察酵母菌生長狀態(tài)，盡量收集生長期處于對數(shù)期的酵母菌。

2）將適量體積的酵母菌液轉(zhuǎn)移至將2 mL旋蓋尖底離心管中（無菌，無核酸酶），于室溫下14000×g 離心1 min。

3）棄盡培養(yǎng)基，將酵母細胞沉淀迅速置于液氮中冷凍1-3 h以上（凍存時間視組織量而定，保證樣品凍存充分），然后轉(zhuǎn)移至-80 °C長期保存。

4）將樣品管置于管架上固定好后埋在干冰箱的中間部位，大體積干冰運輸

一次提取反應所需細胞數(shù)≤1 X 10^7 ?個，以3 X 10^6-1 X 10^7 ?個為宜，可以將細胞經(jīng)裂解液裂解后凍存運輸。

1、從培養(yǎng)箱中取出貼壁培養(yǎng)的細胞，顯微鏡下觀察細胞，確定生長狀態(tài)良好（正常細胞融合度在80 %左右）;

2、棄去培養(yǎng)基，向細胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中加入 5mL PBS（RNase free）， 清洗一次后棄盡PBS；

3、加入1mlPBS（RNase free）重懸后將細胞轉(zhuǎn)移至 1.5 mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中；

4、離心（依據(jù)客戶實驗室細胞離心步驟，注意細胞離心要適度，不要使細胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機，轉(zhuǎn)速3000g為宜）得到細胞沉淀，棄去PBS，置于液氮中速凍2h后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送。

離心收集的細胞迅速溶于 TRIzol 裂解，參考用量為每 5 X 10^6個細胞加 1 mL TRIzol；細胞溶于 TRIzol 后，如出現(xiàn)成團，需用吸頭將細胞團吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解，室溫靜置5min，之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送。

液氮速凍法：

離心收集的細胞直接液氮速凍，速凍2h后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送。

一次提取反應所需細胞數(shù)≤1 X 10^7 ?個，以3 X 10^6-1 X 10^7 ?個為宜，可以將細胞經(jīng)裂解液裂解后凍存運輸。

1、確定細胞生長狀態(tài)良好；離心得到細胞沉淀（依據(jù)客戶實驗室細胞離心步驟，注意細胞離心要適度，不要使細胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機，轉(zhuǎn)速3000g為宜）；

2、棄去培養(yǎng)基，加入 1 mlLPBS（RNase free，室溫），輕輕將細胞沉淀懸起， 轉(zhuǎn)移至 1.5 mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中；

3、離心（依據(jù)客戶實驗室細胞離心步驟，注意細胞離心要適度，不要使細胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機，轉(zhuǎn)速3000g為宜）得到細胞沉淀，棄去PBS，置于液氮中速凍2h后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送。

TRIzol 裂解法（僅限于RNA類產(chǎn)品）：

離心收集的細胞迅速溶于 TRIzol 裂解，參考用量為每 5 X 10^6個細胞加 1 mL TRIzol；細胞溶于 TRIzol 后，如出現(xiàn)成團，需用吸頭將細胞團吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解，室溫靜置5min，之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送。

*注：判斷裂解液加入量是否合適的標準可以根據(jù)細胞溶解物的黏度來判斷。在細胞剛?cè)芙鈺r，可以發(fā)現(xiàn)有絲狀物出現(xiàn)，若裂解液加入量合適，吹打幾次后，絲狀物會消失，液體黏稠性下降；若裂解液的量過少，絲狀物往往一直存在，液體黏稠性大，應繼續(xù)補加裂解液。裂解液加入量過少，會導致抽提的 RNA 降解。

收集的細胞直接液氮速凍后，轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送。

1、采血管選擇

采集血液進行檢測面臨的一個主要問題就是細胞內(nèi) RNA 的不穩(wěn)定性，RNA 在采血后數(shù)小時內(nèi)便會迅速降解。此外，某些種屬的 RNA 在采血后會通過基因誘導在體外增加。體外RNA 降解和基因誘導均可導致體內(nèi)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄本數(shù)目低估或高估。

BD 公司的 PAXgene 血液 RNA 管內(nèi)含能夠穩(wěn)定體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄性狀的添加劑，它能夠減少體外 RNA 的降解，并將基因誘導的水平降低到最小程度，適用于人和靈長類動物全血樣品制備，對于全血樣品，我們只推薦使用此管送樣。

BD PAXgene 血液 RNA 管（貨號 762165）

2、采集血液

使用PAXgene血液RNA管前請仔細閱讀產(chǎn)品說明書，以便進行正確的操作。如果PAXgene血液 RNA 管為唯一的抽血管，則將血液抽入 PAXgene 血液 RNA 管之前應先抽血入“廢棄管”內(nèi)，使抽血過程中所用的采血器內(nèi)能被血液預灌注；否則 PAXgene 血液 RNA 管應為抽血程序中的最后一只試管。確保血液已停止流入試管再從持針器上取下試管（PAXgene 血液 RNA管內(nèi)的負壓設(shè)計可向管內(nèi)抽 2.5ml 的血）。

采血后應立即將 PAXgene 血液 RNA 管輕輕地顛倒 8-10 次，以確保管內(nèi)保護劑和血液充分混合均勻。

3、保存、運輸

將 PAXgene 血液 RNA 管豎直置于室溫（18-25℃）靜置 2-24 小時，之后可貯藏于-20℃或更低溫度；若試管要貯藏于低于-20℃的溫度，先在-20℃冷凍 24 小時，然后再將其轉(zhuǎn)移到-70℃或-80℃，可保存至少 50 個月。大體積干冰運輸。

2、上下輕輕顛倒混勻十次后，分裝到常規(guī)EP管中，轉(zhuǎn)移至-20或-80 °C長期保存（實際根據(jù)采血管的說明要求操作）

3、干冰運輸

注：采集完血液之后需將血液轉(zhuǎn)移至EP管中，玻璃材質(zhì)采血管冷凍之后易碎

制備常見問題匯總

所有組織樣品務必根據(jù)質(zhì)量多少選擇使用下圖的螺紋管保存，嚴禁直接裝入密封袋或錫箔紙（低溫凍脆易破裂，導致樣品泄露，交叉污染）保存

組織送樣量要求

建議送樣量適用于95%的物種組織，少部分組織因胞內(nèi)核酸量較低，需適當增加送樣量，比如植物果實、根等。送樣量過少或過多均不利于提取實驗，下限為建議量的一半，上限為建議量的3倍。隨著技術(shù)發(fā)展，當前大部分產(chǎn)品建庫起始量較低，不需要太多組織，采樣量過多反而會造成速凍不徹底、提取取樣困難、凍融降解等危險。

1、RNA類產(chǎn)品建議組織送樣量

2、二代DNA類產(chǎn)品建議組織送樣量

3、三代DNA類產(chǎn)品建議組織送樣量