“療猘犬咬人方，仍殺所咬犬，取腦敷之，后不復(fù)發(fā)”—東晉?葛洪《肘后備急方》
這是最早關(guān)于人類免疫學(xué)應(yīng)用的記錄。公元前?400?年，中國可能已有人痘苗接種預(yù)防天花的方法，到?16?世紀(jì)明朝隆慶年間，人痘接種法得到重大改進(jìn)并廣泛應(yīng)用，17?世紀(jì)傳入俄國、朝鮮、日本、土耳其和英國等國家，至18世紀(jì)末結(jié)束經(jīng)驗(yàn)免疫學(xué)時期，隨后免疫學(xué)又經(jīng)歷了經(jīng)典免疫學(xué)時期，近代免疫學(xué)時期，直到1965年/1968年?B細(xì)胞/T細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)開啟了現(xiàn)代免疫學(xué)時期。
隨著免疫學(xué)的逐步發(fā)展，免疫組學(xué)技術(shù)也隨之進(jìn)入了迅速發(fā)展的時期，先后發(fā)展出了標(biāo)記免疫組技術(shù)、免疫組化技術(shù)、Bulk?T/BCR測序技術(shù)以及近幾年興起的單細(xì)胞T/BCR測序技術(shù)，并帶動了相關(guān)科學(xué)的進(jìn)步。
2017年，張澤民院士研究組，通過大規(guī)模單細(xì)胞測序技術(shù)對肝癌相關(guān)T淋巴細(xì)胞進(jìn)行分析，首次在單細(xì)胞水平上描繪肝癌微環(huán)境中免疫細(xì)胞圖譜，發(fā)現(xiàn)了肝癌免疫療法的潛在靶點(diǎn)，也為我們從多角度系統(tǒng)性理解肝癌T淋巴細(xì)胞特征奠定了基礎(chǔ)。（2017，Cell，Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing）
2024年，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院樊嘉院士和高強(qiáng)教授、中國科學(xué)院上海免疫與感染研究所張曉明研究員、浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院郭國驥教授合作在Science上發(fā)表了題為A blueprint for tumor-infiltrating B cells across human cancers的研究論文，結(jié)合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、 B細(xì)胞受體免疫組庫和表觀基因組的多組學(xué)數(shù)據(jù)，系統(tǒng)性地刻畫了腫瘤浸潤性B細(xì)胞的異質(zhì)性、動態(tài)分化和表觀調(diào)控機(jī)制。創(chuàng)新地揭示了腫瘤微環(huán)境中廣泛存在的EF應(yīng)答的癌種偏好性、空間定位特征、臨床意義及潛在的誘導(dǎo)調(diào)控機(jī)制。
但是，與逐漸成熟的單細(xì)胞T/BCR測序不同，空間T/BCR測序測序技術(shù)還一直未能有較好的測序技術(shù)產(chǎn)品去做支撐，成果尚少，現(xiàn)有的文章技術(shù)還局限于使用早期的低分辨率轉(zhuǎn)錄芯片為依托。成熟穩(wěn)定且高分辨率的空間T/BCR測序技術(shù)產(chǎn)品的缺乏限制了空間免疫組的研究。
百創(chuàng)空間全長免疫組庫測序技術(shù)?BMKMANU?S3000-VDJ
2024年12月，百邁客生物智能制造以廣受市場好評的亞細(xì)胞級S系列空間轉(zhuǎn)錄組芯片為依托，開發(fā)出了在原片上可同時捕獲3’端轉(zhuǎn)錄組信息以及全長B細(xì)胞受體（BCR）和T細(xì)胞受體（TCR）序列的空間T/BCR測序技術(shù)產(chǎn)品—BMKMANU?S3000-VDJ?，將填補(bǔ)這一技術(shù)產(chǎn)品的缺口。
實(shí)測案例-某腫瘤-百創(chuàng)單細(xì)胞級空間免疫組結(jié)果
BMKMANU?S3000-VDJ?技術(shù)，使用新鮮OCT包埋樣本，在分辨率為3.5μm的芯片上同一張組織切片（10μm）實(shí)現(xiàn)3’端mRNA，以及全長TCR/BCR的捕獲。利用百邁客生物智能制造獨(dú)有的圖像校準(zhǔn)及細(xì)胞分割技術(shù)，得到單細(xì)胞級分辨率的空間轉(zhuǎn)錄組結(jié)果及單細(xì)胞級分辨率的空間T/BCR數(shù)據(jù)。
BMKMANU?S3000-VDJ??技術(shù)路線
精準(zhǔn)空間細(xì)胞注釋
得到的單細(xì)胞級空間轉(zhuǎn)錄組結(jié)果，可以進(jìn)行常規(guī)的空間轉(zhuǎn)錄組分析，并進(jìn)行精準(zhǔn)的細(xì)胞注釋。
精準(zhǔn)細(xì)胞注釋及T/B細(xì)胞的空間分布
T/B細(xì)胞的亞群定位
對于得到的T細(xì)胞及B細(xì)胞又可以繼續(xù)進(jìn)行詳細(xì)的亞群分類，同時探討亞群之前的相互轉(zhuǎn)換關(guān)系以及與表型之前的關(guān)系。
T/B Cells 亞群分類，亞群空間分布及亞群發(fā)育軌跡分析
TCR/BCR?空間分布以及豐度分析
TCR和BCR的豐度分析可以揭示免疫反應(yīng)的多樣性和動態(tài)變化。例如，TCR的多樣性在腫瘤進(jìn)展過程中會發(fā)生變化，早期肝癌患者的TCR和BCR均勻性更高，而晚期患者則表現(xiàn)出較低的均勻性。此外，TCR和BCR的豐度變化也可以反映免疫細(xì)胞的激活狀態(tài)和克隆擴(kuò)增情況。
克隆型空間分布以及豐度分析
腫瘤樣本我們可以類比為一處具有復(fù)雜地貌的特殊地理環(huán)境，不同的環(huán)境造就了各種細(xì)胞的不同狀態(tài)，而T/B細(xì)胞在不同的“選擇壓力”下邊進(jìn)行了不同的“適應(yīng)性進(jìn)化”。對不同生態(tài)位的T/B細(xì)胞尤其是TCR/BCR進(jìn)行測定，有助于我們?nèi)ソ沂久庖呒?xì)胞的克隆起源和進(jìn)化過程。例如，通過分析TCR的VDJ重排，可以追蹤T細(xì)胞克隆的起源和擴(kuò)增過程。這種分析有助于理解免疫細(xì)胞在不同生理和病理狀態(tài)下的動態(tài)變化。
百創(chuàng)單細(xì)胞級空間全長免疫組產(chǎn)品?BMKMANU?S3000-VDJ，將幫助科研者解決整個轉(zhuǎn)錄組和組織形態(tài)學(xué)問題，實(shí)現(xiàn)人類腫瘤或其它病變組織中B細(xì)胞和T細(xì)胞克隆的高保真定位和空間譜系追蹤，將在一定程度上促進(jìn)對各種臨床相關(guān)現(xiàn)象（如感染、疫苗接種和癌癥）中淋巴細(xì)胞空間動力學(xué)的理解。
]]>百邁客生物為該研究提供了百創(chuàng)S1000空間轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)。
單細(xì)胞組學(xué)和時空組學(xué)是近年來生命科學(xué)領(lǐng)域的重要技術(shù)突破，它們在細(xì)胞異質(zhì)性解析、動態(tài)過程研究和細(xì)胞間相互作用分析方面具有重要優(yōu)勢，為生命科學(xué)研究帶來了全新的視角和深度。水稻稻瘟病是世界上發(fā)生嚴(yán)重的真菌病害之一，水稻在面臨稻瘟菌侵染時會激活動態(tài)免疫，因此挖掘水稻特異免疫基因?qū)τ诳沟疚敛【秩局陵P(guān)重要。
該研究對稻瘟菌接種后三個時間點(diǎn)的樣品進(jìn)行了單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測序(圖1A)，同時對接種后的水稻葉片也進(jìn)了時空組測序(圖1B)。
圖1?水稻樣品單細(xì)胞及時空組測序流程圖
對測序獲得的單細(xì)胞數(shù)據(jù)，結(jié)合細(xì)胞特異的標(biāo)志基因，AddModuleScore?軟件和GO富集分析等方法，對水稻的細(xì)胞類型進(jìn)行了分類注釋(圖2A)?；虮磉_(dá)分析發(fā)現(xiàn)，維管細(xì)胞中的原形成層細(xì)胞在稻瘟菌侵染后高度誘導(dǎo)二萜類植保素合成代謝相關(guān)基因的表達(dá)，其中水稻關(guān)鍵植保素momilactone A合成被特異誘導(dǎo)(圖2B)，促進(jìn)了momilactone A在維管組織中積累，可能是抗稻瘟病的關(guān)鍵因素。相反，激素途徑和模式分子激發(fā)的免疫對抗病性貢獻(xiàn)較弱。
圖2?水稻單細(xì)胞測序結(jié)果及差異基因表達(dá)分析
共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，稻瘟菌孢子萌發(fā)后優(yōu)先靶向葉脈入侵，但是水稻的維管組織具有較強(qiáng)的免疫，稻瘟菌菌絲無法進(jìn)一步侵入(圖3A)。時空組測序結(jié)果顯示，富含亮氨酸重復(fù)序列的(NLR)免疫基因的表達(dá)在接種24小時后，葉尖部較葉基部具有更強(qiáng)的積累，表明免疫基因的表達(dá)具有極性的特征。綜上所述，該項(xiàng)研究揭示了水稻在稻瘟病菌侵染時免疫基因存在細(xì)胞特異性和多維(局部和縱向)的表達(dá)模式，為挖掘新的免疫基因提供了重要的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)(圖3B)。
圖3 ?共聚焦顯微鏡觀察及時空組測序結(jié)果顯示水稻組織存在多維度的免疫
內(nèi)容來源于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，侵刪
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該研究將空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)應(yīng)用于小麥籽粒發(fā)育研究，根據(jù)基因表達(dá)和位置信息詳細(xì)劃分細(xì)胞功能亞群，揭示了小麥籽粒發(fā)育過程的空間轉(zhuǎn)錄特征，繪制了小麥籽粒三維基因表達(dá)圖譜。
百邁客生物為該研究提供了空間轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)。
小麥（Triticum aestivum L.）是全球三大主糧作物之一，種植面積約2.3億公頃，其產(chǎn)量提升對保障全球糧食安全與營養(yǎng)供給至關(guān)重要。小麥籽粒主要由三部分組成：二倍體胚、三倍體胚乳及果皮（種皮）。這些組織在發(fā)育過程中表現(xiàn)出顯著的基因表達(dá)時空特異性，形成功能分化的區(qū)室化結(jié)構(gòu)。盡管這些組織在細(xì)胞類型和生理功能上存在明顯差異，但它們通過協(xié)同調(diào)控構(gòu)建了獨(dú)特的籽粒發(fā)育微環(huán)境，共同決定籽粒的最終表型。然而，目前對籽粒細(xì)胞類型的認(rèn)知仍主要依賴于形態(tài)學(xué)觀察和少量標(biāo)記基因的表達(dá)分析，常規(guī)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)因缺乏空間分辨率，極大限制了對籽粒發(fā)育調(diào)控機(jī)制的深入解析及關(guān)鍵功能基因的挖掘。
為系統(tǒng)解析小麥籽粒發(fā)育的分子機(jī)制，該研究采用時空轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，構(gòu)建了籽粒在發(fā)育早期4 DAP、8 DAP和12 DAP的高分辨率基因表達(dá)圖譜，實(shí)現(xiàn)了近8萬個基因的空間表達(dá)可視化，并鑒定了10個特征明確的細(xì)胞亞群及190個籽粒特異性標(biāo)記基因。研究發(fā)現(xiàn)，不同組織特異性基因（尤其是轉(zhuǎn)錄因子）呈現(xiàn)動態(tài)表達(dá)模式。通過共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和順式調(diào)控元件分析，鑒定到一個關(guān)鍵調(diào)控因子——轉(zhuǎn)錄因子TaABI3-B1，其在胚胎及胚乳周圍組織中特異性表達(dá)，并負(fù)向調(diào)控胚胎和籽粒大小。進(jìn)一步利用等位基因變異體和轉(zhuǎn)基因材料驗(yàn)證了TaABI3-B1在胚胎和胚乳發(fā)育中的關(guān)鍵作用。
該研究不僅為小麥籽粒發(fā)育提供了全面的時空轉(zhuǎn)錄組資源，還揭示了調(diào)控籽粒大小的新機(jī)制，為小麥分子設(shè)計(jì)育種和產(chǎn)量提升提供了重要理論依據(jù)。
內(nèi)容來源于北京大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院，侵刪
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通過對多組學(xué)數(shù)據(jù)的深度整合分析，該研究全面探究了重要木本經(jīng)濟(jì)植物核桃（Juglans regia）及其近緣種在基因組層面的遺傳變異特征。同時，深入剖析了核桃果實(shí)發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄代謝調(diào)控機(jī)制，揭示了表觀遺傳修飾以及空間轉(zhuǎn)錄調(diào)控在其中的關(guān)鍵作用，并對相關(guān)候選基因的功能進(jìn)行了系統(tǒng)分析。該研究為深入理解核桃果殼基因變異及其網(wǎng)絡(luò)遺傳調(diào)控機(jī)制提供了全新的視角和理論依據(jù)，為推動核桃分子育種技術(shù)的創(chuàng)新發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
百邁客生物為該研究提供了植物空間轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)。
研究背景
核桃（Juglans regia）是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價值的堅(jiān)果油料樹種；其果實(shí)具有堅(jiān)硬的內(nèi)果皮/果殼以保護(hù)種子，這在其進(jìn)化過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，而果殼厚度是核桃育種的一個重要性狀。然而，與核桃果殼發(fā)育相關(guān)的基因組景觀和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未得到系統(tǒng)的闡明。
研究內(nèi)容
該研究組裝注釋了核桃品種“香玲”的高質(zhì)量基因組，并構(gòu)建了涵蓋八個胡桃屬物種的圖形結(jié)構(gòu)泛基因組，以揭示基因組水平上的遺傳變異。重新測序了285份樣本，揭示了其群體基因組景觀變異圖譜。通過全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS），研究發(fā)現(xiàn)了19個與核桃馴化和改良過程中受到選擇的268多個位點(diǎn)相關(guān)的基因座。
圖1-核桃比較基因組學(xué)與遺傳變異分析
圖2-核桃果殼/內(nèi)果皮十一個發(fā)育階段基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及動態(tài)形態(tài)變化
通過對十一個發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)、DNA甲基化和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)等多組學(xué)分析，揭示了多個與次生細(xì)胞生物合成和木質(zhì)素積累相關(guān)的候選基因，例如UGP、MYB308、MYB83、NAC043、NAC073、CCoAOMT1、CCoAOMT7、CHS2、CESA7、LAC7、COBL4和IRX12。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中過表達(dá)JrUGP和JrMYB308驗(yàn)證了它們在木質(zhì)素生物合成和細(xì)胞壁加厚中的作用。
研究結(jié)論
植物的果實(shí)特征，包括核桃（Juglans）的堅(jiān)硬內(nèi)果皮，在種子傳播、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效率和遺傳多樣性方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其中殼厚對核桃的生產(chǎn)和育種有著顯著影響。綜合多組學(xué)分析探究了核桃殼厚度這一關(guān)鍵性狀以及與木質(zhì)素積累和細(xì)胞壁增厚相關(guān)的內(nèi)果皮發(fā)育，為木本作物的遺傳學(xué)和調(diào)控機(jī)制提供了新的見解，助力基于基因組信息的改良育種策略。全面多組學(xué)研究結(jié)果為核桃的遺傳變異和內(nèi)果皮發(fā)育及果殼厚度的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控提供了新的見解，并為核桃品種改良的基因組信息育種策略提供了可能。
圖4-該研究主要發(fā)現(xiàn)概括模型
內(nèi)容來源于西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，侵刪
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文章標(biāo)題：Spatial and single-cell transcriptomics reveal cellular heterogeneity and a novel cancer-promoting Treg cell subset in human clear-cell renal cell carcinoma
期刊名稱：Journal for ImmunoTherapy of Cancer
影響因子：10.3
合作單位：空軍軍醫(yī)大學(xué)（第四軍醫(yī)大學(xué)）
研究方法：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，空間轉(zhuǎn)錄組測序，流式分選，RT-qPCR，Western blot，免疫組化，多重免疫組化，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
百邁客生物為該研究提供了百創(chuàng)DG1000單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)以及百創(chuàng)S1000空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)服務(wù)，文中百創(chuàng)S1000空間數(shù)據(jù)分析得到的細(xì)胞空間分布圖由百創(chuàng)開發(fā)軟件BSTCellViewer展示。
研究背景
透明腎細(xì)胞癌ccRCC是腎細(xì)胞癌RCC的常見亞型，是腎癌相關(guān)死亡的主要原因，治療手段包括腎切除手術(shù)、靶向治療和免疫治療，但多數(shù)患者不能從免疫治療獲益，這與腫瘤微環(huán)境異質(zhì)性有關(guān)，因此有必要深入理解ccRCC的腫瘤微環(huán)境，助力開發(fā)新型個性化診療方案。
材料及方法
研究材料：15名腎切除術(shù)的ccRCC患者組織樣本及其血液PBMC。對組織樣本區(qū)域進(jìn)行定義，分為腫瘤核心（TC），腫瘤-健康交界（IF，包括腫瘤邊緣TR和臨近健康腎組織AN），遠(yuǎn)端健康腎組織DN。
組別設(shè)計(jì)：實(shí)驗(yàn)組4名ccRCC患者樣本進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序&空間轉(zhuǎn)錄組測序，驗(yàn)證組15名ccRCC患者樣本進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)&多重免疫熒光染色，151名ccRCC患者組織樣本&40名其他腎癌亞型患者組織樣本&6名捐獻(xiàn)者健康腎組織進(jìn)行多重?zé)晒饷庖呓M化染色。
研究方法：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（4名患者不同區(qū)域腫瘤組織，按照CD45+細(xì)胞:CD45-細(xì)胞=9:1增加免疫細(xì)胞數(shù)據(jù)占比，n=12），空間轉(zhuǎn)錄組測序（n=4）；流式分選，RT-qPCR，Western blot，免疫組化，多重免疫組化，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
研究結(jié)果
1.ccRCC組織細(xì)胞類型全面分析
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)顯示不同患者腫瘤組織的免疫微環(huán)境細(xì)胞組成相似，T細(xì)胞占比最高，特別是CD4+ T細(xì)胞。腫瘤區(qū)域（TC/TR）富集CD3+細(xì)胞以及CD8+ T細(xì)胞，而CD4+ T細(xì)胞基本分布在所有區(qū)域。此外，基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞豐度和分布存在差異，TR區(qū)域成纖維細(xì)胞比例顯著低于TC區(qū)域和AN區(qū)域，這一發(fā)現(xiàn)也在空間轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)中得到印證。
圖1-ccRCC組織中細(xì)胞群的全面分析
2.ccRCC細(xì)胞元程序的豐度以及異質(zhì)性
通過非負(fù)矩陣因子分解分析每個樣本scRNA-seq數(shù)據(jù)，得到可以代表ccRCC腫瘤細(xì)胞簇元程序的6個基因集，不同基因集代表著不同的程序，如基因集1代表著EMT（上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變）相關(guān)基因表達(dá)譜，基因集5也與EMT相關(guān)但與基因集1不同的是其包含VEGFA等。
進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)ccRCC亞群0~4簇與不同基因集表達(dá)譜匹配，5和6簇不與任何基因集匹配但具有細(xì)胞周期和應(yīng)激響應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)。RCC0簇和RCC2簇代表EMThigh腫瘤細(xì)胞并在IF區(qū)域富集，RCC1簇代表PT（近曲小管）細(xì)胞，擬時序分析結(jié)果顯示存在RCC0—>RCC2分化關(guān)系，但RCC2幾乎只在P2患者樣本中發(fā)現(xiàn)，表明RCC2可能與個別患者特征相關(guān)。RCC1、RCC3和RCC4細(xì)胞主要在組織而不是腫瘤區(qū)域富集，RCC4主要分布在AN和DN區(qū)域，RCC4在AN區(qū)域分布數(shù)量高于DN區(qū)域。RCC4高表達(dá)細(xì)胞因子受體基因，表明TME中分泌的促腫瘤細(xì)胞因子可能傾向于作用到RCC4，增加其轉(zhuǎn)變成癌細(xì)胞的概率，加速腫瘤逃逸，促進(jìn)腫瘤惡性化，與以往瘤旁附近不是完全的健康組織認(rèn)識相符合。
圖2-透明細(xì)胞RCC細(xì)胞元程序的豐度及異質(zhì)性
3.ccRCC基質(zhì)細(xì)胞的區(qū)域化特征和異質(zhì)性
scRNA-seq與空間數(shù)據(jù)均顯示，ccRCC存在8種激活的成纖維細(xì)胞簇，腫瘤區(qū)域成纖維細(xì)胞數(shù)量高于健康組織，其中CD24+IL32+成纖維細(xì)胞顯著富集在腫瘤區(qū)域，PTGDS+成纖維細(xì)胞幾乎全分布在AN，高表達(dá)ECM（胞外基質(zhì)）形成和EMT的成纖維細(xì)胞簇在IF較為富集，IL1R1+?CAF（腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞）表現(xiàn)出腫瘤促進(jìn)表型；7種EC（內(nèi)皮細(xì)胞）簇中4種（0,2,3和6）主要富集在腫瘤組織，3種（1,4和5）在健康組織富集，膠原蛋白EC（0簇）豐度最高，具有促腫瘤特征?？傊?，不同的ECM蛋白質(zhì)產(chǎn)生基質(zhì)細(xì)胞傾向于富集在IF并共定位，可能行駛多種功能，包括細(xì)胞-細(xì)胞交互和胞外組分重構(gòu)。
圖3-透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中基質(zhì)細(xì)胞的區(qū)域特征和異質(zhì)性
4.ccRCC中MRC1+FOLR2+?TAM傾向于表現(xiàn)出更強(qiáng)的促癌表型
scRNA-seq數(shù)據(jù)與空間數(shù)據(jù)均顯示，4種TAM簇具有不同分布趨勢，TAM1主要分布在TC區(qū)域；TAM2高表達(dá)FOLR2、MRC1和CD163，可能是M2樣巨噬細(xì)胞且具有增強(qiáng)的免疫抑制特征，TAM4是組織駐留巨噬細(xì)胞，兩者主要分布在TR區(qū)域；TAM3表達(dá)炎癥響應(yīng)相關(guān)基因，在TR和AN區(qū)域富集。RNA速率分析顯示存在TAM4—>TAM2—>TAM1和TAM4—>TAM3兩種軌跡，以及從IF區(qū)域遷移到TC區(qū)域的趨勢。進(jìn)一步的功能分析顯示，IF區(qū)域的TAM2可能通過促進(jìn)EMT，TC區(qū)域的TAM2可能通過促進(jìn)腫瘤血管生成，起到促癌效應(yīng)?？傊?strong>TAM2不同的腫瘤促進(jìn)效應(yīng)可能與免疫抑制TME有關(guān)。
圖4-透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中MRC1+FOLR2+?TAM傾向于表現(xiàn)更強(qiáng)的促癌表型
5.單細(xì)胞分析揭示ccRCC中存在表達(dá)IL1B的Treg
進(jìn)一步分析CD4+ T細(xì)胞簇，發(fā)現(xiàn)存在CD4+ 初始T細(xì)胞、Treg和濾泡樣輔助T細(xì)胞，不同簇的特征基因和空間分布模式不同，IF區(qū)域富集CD4+ 初始T細(xì)胞和PDE3B+ CD4+ T細(xì)胞，腫瘤區(qū)域富集Treg。其中，TC/TR區(qū)域CTLA-4+?Treg的占比以及Treg的FoxP3蛋白表達(dá)水平高于AN/DN區(qū)域，而CTLA-4+FoxP3-?Treg在所有組織中的分布較為均勻，表明腫瘤區(qū)域Treg細(xì)胞具有更強(qiáng)的免疫抑制功能。
進(jìn)一步分析Treg細(xì)胞簇，發(fā)現(xiàn)存在6種亞型，其中終末效應(yīng)Treg細(xì)胞（5）主要分布在IF區(qū)域，F(xiàn)OXP3表達(dá)水平較低且ICOS表達(dá)水平降低，表明細(xì)胞可能處于不穩(wěn)定狀態(tài)。
此外，終末效應(yīng)Treg細(xì)胞表達(dá)炎癥性細(xì)胞因子如IL1B，IL18和IL7，驗(yàn)證隊(duì)列的多重免疫熒光染色結(jié)果顯示IL-1β+終末效應(yīng)Treg是對ccRCC特異性腫瘤微環(huán)境信號的特異性響應(yīng)。發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中存在表達(dá)炎癥性細(xì)胞因子IL1B的終末效應(yīng)Treg細(xì)胞。
圖5-單細(xì)胞分析揭示透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌存在表達(dá)IL1B的Treg細(xì)胞群
6.IL-18通過ERK/NF-κB通路促進(jìn)強(qiáng)免疫抑制功能的終末效應(yīng)Treg細(xì)胞產(chǎn)生
空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果顯示不同Treg細(xì)胞100μm范圍內(nèi)激活的CD4+/CD8+ T細(xì)胞數(shù)量較少，終末效應(yīng)Treg細(xì)胞100μm范圍內(nèi)CD4+/CD8+ T細(xì)胞數(shù)量更少，表明終末效應(yīng)Treg細(xì)胞周圍應(yīng)答Treg細(xì)胞（Tresp）增殖受到更強(qiáng)的抑制。細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明終末效應(yīng)Treg細(xì)胞具有強(qiáng)免疫抑制功能。RNA速率分析結(jié)果表明效應(yīng)終末Treg可能由初始Treg細(xì)胞分化而來，體外實(shí)驗(yàn)表明IL-18可刺激CD4+CD25+ Treg細(xì)胞上調(diào)IL-1β表達(dá)，表明終末效應(yīng)Treg細(xì)胞產(chǎn)生和作用可能與IL-18有關(guān)。ERK激活劑/NF-κB激活劑促進(jìn)IL-18+ Treg細(xì)胞的產(chǎn)生，IL-18處理后Treg細(xì)胞ERK/NF-κB磷酸化水平增加，ERK抑制劑可抑制Treg細(xì)胞表達(dá)NF-κB但NF-κB抑制劑無法抑制ERK表達(dá)，綜上，這些結(jié)果表明IL-18可能通過ERK/NF-κB通路介導(dǎo)終末效應(yīng)Treg細(xì)胞的產(chǎn)生。
圖6-IL-18通過ERK/NF-κB通路促進(jìn)具有強(qiáng)免疫抑制功能的終末效應(yīng)Treg細(xì)胞產(chǎn)生
7.通過與MRC1+FLOR2+?TAM互作，終末效應(yīng)Treg細(xì)胞與存活率降低、免疫逃逸增加及腫瘤生長相關(guān)
確定終末效應(yīng)Treg細(xì)胞標(biāo)志基因（FOXP3、IL1B和FCER1G），TGCA泛癌數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，終末效應(yīng)T細(xì)胞浸潤高的隊(duì)列與更低的整體存活率相關(guān)。細(xì)胞通訊分析結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞與終末效應(yīng)Treg細(xì)胞有著最多的互作配體-受體對，許多是免疫抑制互作，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)支持終末效應(yīng)Treg細(xì)胞與TAM2簇之間存在相互作用；IL1R1+?CAF與終末效應(yīng)Treg細(xì)胞也存在潛在聯(lián)系。僅在TC區(qū)域（與TR區(qū)域相比）發(fā)現(xiàn)NAMPT-INSR和TGFB1-(TGFBR1+TGFBR2)配受體互作，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)終末效應(yīng)Treg細(xì)胞LRRC32（該基因編碼的GARP是TGF-β1成熟和激活所必須的）表達(dá)水平高于傳統(tǒng)Treg細(xì)胞。
此外，巨噬細(xì)胞特別是TAM2高表達(dá)IL18。這些結(jié)果可能表明ccRCC腫瘤微環(huán)境中，IF區(qū)域終末效應(yīng)Treg細(xì)胞與臨近TAM2互作，通過分泌的TGF-β1、M-CSF1以及IL-10，將IF駐留的TAM轉(zhuǎn)變成促癌表型，引起腫瘤細(xì)胞EMT；TAM2分泌的趨化因子誘導(dǎo)Treg細(xì)胞遷移到腫瘤區(qū)域并過表達(dá)IL-18，將Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)變成IL-1β+ 終末效應(yīng)T細(xì)胞，抑制T細(xì)胞免疫并促進(jìn)腫瘤生長。
總之，這些結(jié)果表明ccRCC的IF區(qū)域，終末效應(yīng)Treg細(xì)胞可能與其他促癌細(xì)胞互作，最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，支持了終末效應(yīng)Treg細(xì)胞具有免疫抑制和促癌作用的假設(shè)。
研究結(jié)果
該研究系統(tǒng)描述了ccRCC中不同類型細(xì)胞的基因表達(dá)譜和空間分布規(guī)律，發(fā)現(xiàn)一種具有癌癥促進(jìn)作用的新Treg細(xì)胞亞型，在腫瘤-健康組織交界區(qū)域與MRC1+FOLR2+?TAM互作，構(gòu)建免疫抑制TME，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化最終引起患者存活率降低。同時，這些發(fā)現(xiàn)也為開發(fā)新的藥物和預(yù)后標(biāo)志物提供了靶點(diǎn)。
參考文獻(xiàn)：
Song X, et al. Spatial and single-cell transcriptomics reveal cellular heterogeneity and a novel cancer-promoting Treg cell subset in human clear-cell renal cell carcinoma. J Immunother Cancer. 2025 13(1):e010183.
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2025年3月，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院器官移植研究所蘭培祥教授、陳知水教授和肝臟外科程琪教授研究團(tuán)隊(duì)在Journal of Hepatology發(fā)表題為”Sour Neuronal Signalling Attenuates Macrophage Mediated Liver Injury”的研究論文。研究使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)等多種技術(shù)，深入闡述人鼠中減輕肝缺血再灌注損傷的腦-肝軸調(diào)控通路，發(fā)現(xiàn)酸味刺激竟然可以通過神經(jīng)信號緩解肝臟損傷！這一發(fā)現(xiàn)不僅為肝臟疾病的治療提供了新思路，還從現(xiàn)代科學(xué)的角度驗(yàn)證了中醫(yī)“酸入肝”的理論。
文章標(biāo)題：Sour Neuronal Signalling Attenuates Macrophage Mediated Liver Injury
期刊名稱：Journal of Hepatology
影響因子：26.7
合作單位：華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院
百邁客生物為該研究提供了10X單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)服務(wù)。
研究背景
在中醫(yī)理論中，酸味與肝臟有著密切的關(guān)系。中醫(yī)經(jīng)典《黃帝內(nèi)經(jīng)》中提到“酸入肝”，認(rèn)為酸味食物能夠滋養(yǎng)肝臟，調(diào)和氣血，促進(jìn)肝臟的生理功能。像檸檬、山楂、醋等酸味食物，常被用來調(diào)理肝氣郁結(jié)、疏肝解郁。這次的研究，不僅讓中醫(yī)的古老智慧得到了科學(xué)驗(yàn)證，還為酸味在肝臟疾病治療中的應(yīng)用提供了新的依據(jù)。
肝損傷是多種肝病常見的病理生理基礎(chǔ)，與炎癥有關(guān)。肝缺血再灌注損傷是一種局部無菌炎癥響應(yīng)，主要由先天免疫細(xì)胞驅(qū)動，是肝切除術(shù)中早期器官功能障礙和衰竭的重要原因。傳統(tǒng)認(rèn)為肝缺血再灌注引起的炎癥是由肝和死亡細(xì)胞釋放的DAMP（損傷相關(guān)分子蛋白）被肝駐留庫普夫細(xì)胞、單核細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞等識別，釋放趨化因子和促炎癥因子，招募循環(huán)白細(xì)胞促使炎癥發(fā)生。此外，近年來，神經(jīng)免疫調(diào)控成為研究熱點(diǎn)，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)系統(tǒng)可以通過釋放神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)肽等分子來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。然而，如何通過神經(jīng)信號來治療肝臟炎癥，仍然是一個未解之謎。
材料及方法
研究方法：單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測序（n=3，肝及腹腔神經(jīng)節(jié)），組織學(xué)染色，熒光染色，病毒示蹤，免疫印記，免疫沉淀串聯(lián)質(zhì)譜，bulk RNA-seq，qRT-PCR，流式細(xì)胞術(shù)等。
研究材料：C57BL/6J小鼠缺血再灌注損傷模型，Fam19a2-/-Ccr2-/-小鼠，小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT122。
研究結(jié)果
1.酸刺激減輕肝缺血再灌注損傷
研究者首先構(gòu)建酸刺激下肝臟缺血再灌注損傷（IRI）小鼠模型，發(fā)現(xiàn)酸刺激可以減少肝組織損傷以及血清標(biāo)志物水平。但是，使用丁卡因局麻小鼠舌頭或者灌胃檸檬酸不能減少肝損傷和血清標(biāo)志物水平；NMDAR阻斷劑1（阻斷NMDAR介導(dǎo)的興奮性突觸傳遞）立體定位注射到腹后內(nèi)側(cè)核（VPN）后，酸刺激后IRI肝的血清標(biāo)志物水平和肝損傷程度無明顯變化，表明神經(jīng)系統(tǒng)在酸刺激減輕IRI過程中起重要作用。此外，小鼠VPN注射示蹤病毒的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肝臟以及CG（腹腔神經(jīng)節(jié)）均檢測到熒光，行腹腔神經(jīng)節(jié)切除術(shù)能降低IRI肝的組織損傷和血清標(biāo)志物水平，表明酸刺激減輕肝損傷過程通過腦-CG-肝軸。
圖1-酸通過神經(jīng)減輕小鼠肝臟缺血再灌注損傷
圖2-腦和肝中分布的H129感染神經(jīng)
2.酸刺激通過減少TAFA2產(chǎn)生降低肝IRI
對肝IRI小鼠、酸刺激后肝IRI小鼠及sham（假手術(shù)）小鼠的肝臟和CG進(jìn)行單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果顯示IRI引起肝細(xì)胞和神經(jīng)元基因表達(dá)譜發(fā)生變化，IRI肝中免疫細(xì)胞數(shù)量增加，但酸刺激后IRI樣本中免疫細(xì)胞數(shù)量減少。神經(jīng)元較為特異性地表達(dá)TAFA2，IRI可引起肝神經(jīng)元TAFA2表達(dá)水平增加，但酸刺激使得TAFA2表達(dá)水平降到與sham對照組相近水平。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鉀離子可引起小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22顯著高表達(dá)TAFA2，使用鉀離子通道抑制劑可減輕肝損傷，支持酸刺激通過神經(jīng)系統(tǒng)減輕肝損傷的假設(shè)。進(jìn)一步的，使用慢病毒敲低神經(jīng)元TAFA2表達(dá)水平或使用TAFA2敲基因鼠，發(fā)現(xiàn)IRI引起的肝組織損傷、巨噬細(xì)胞浸潤以及血清標(biāo)志物水平降低，表明TAFA2在肝IRI中有著重要作用。
圖3-酸刺激減少小鼠IRI肝中神經(jīng)細(xì)胞Fam19a2表達(dá)水平
圖4-Fam19a2敲除或敲低，使得小鼠肝臟缺血再灌注損傷降低
?3.IRI肝中TAFA2與巨噬細(xì)胞相互作用
體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TAFA2不引起肝細(xì)胞凋亡；snRNA-seq數(shù)據(jù)顯示IRI肝中巨噬細(xì)胞比例增加且炎癥相關(guān)基因表達(dá)水平增加，但在酸刺激組中降低；流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TAFA2與巨噬細(xì)胞結(jié)合而不與T/B細(xì)胞結(jié)合，不論是否酸刺激T/B細(xì)胞比例無顯著變化，IRI肝中CD11b+F4/80low?巨噬細(xì)胞增加而酸刺激可降低該巨噬細(xì)胞數(shù)量；TAFA2敲除或敲低抑制IRI肝中巨噬細(xì)胞的浸潤，這些結(jié)果表明TAFA2促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TAFA2可以激活BMDM（骨髓來源巨噬細(xì)胞），引起Il1α，Il1β，Il6和Tnfα的表達(dá)，這些結(jié)果表明TAFA2激活的巨噬細(xì)胞介導(dǎo)了肝IRI。
圖5-TAFA2使得IRI中巨噬細(xì)胞比例增加，刺激炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生
4.TAFA2通過CCR2與巨噬細(xì)胞互作
體外實(shí)驗(yàn)表明巨噬細(xì)胞上的CCR2是TAFA2受體，CCR2敲除小鼠IRI肝的組織損傷以及巨噬細(xì)胞浸潤降低，血清標(biāo)志物水平降低。TAFA2或CCL2刺激后BMDM的bulk RNA-seq數(shù)據(jù)表現(xiàn)出幾乎一致的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜，粘附、代謝、Ras信號通路相關(guān)差異基因表達(dá)上調(diào)，代謝和核糖體通路相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，TAFA2誘導(dǎo)BMDM更高的表達(dá)Il1α，Il1β，Il6，Tnfα以及干擾素相關(guān)基因，促進(jìn)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥響應(yīng)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明TAFA2促使巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥響應(yīng)主要依賴CCR2，但巨噬細(xì)胞上也可能存在其他的TAFA2受體。
圖6-TAFA2與巨噬細(xì)胞表面CCR2互作
5.酸刺激減輕人類肝切除術(shù)中肝IRI
為了確認(rèn)酸刺激在人類肝IRI中的作用，研究者進(jìn)行了開放、隨機(jī)、空白對照臨床試驗(yàn)（ChiCTR2400088096），包含多種良性/惡性肝腫瘤、肝外傷、膿腫、囊腫和包蟲病，由于手術(shù)期間門靜脈短暫阻斷以減少肝切除過程中出血，導(dǎo)致肝出現(xiàn)缺血再灌注損傷。干預(yù)組33名患者，術(shù)前24h開始，每8h給與新鮮的25mM檸檬酸（持續(xù)5min），對照組33名患者不接受酸刺激，剔除6名術(shù)中肝缺血超過30min患者以及4名依從性差患者，肝切除術(shù)后第1/3/5天對患者肝功能進(jìn)行評估，結(jié)果顯示酸刺激組血清ALT和AST水平顯著低于對照組，高ALT水平（>500 U/L）患者數(shù)量也顯著更低，這些結(jié)果表明酸刺激可減輕人類肝切除術(shù)引起的肝IRI。
圖7-酸刺激減輕人類肝切除術(shù)中肝IRI
研究總結(jié)
該研究首次揭示了腦-肝軸在肝臟IRI中的調(diào)控作用，闡明了酸味刺激通過神經(jīng)信號通路緩解肝臟損傷的機(jī)制。研究不僅為肝臟IRI的治療提供了新的思路，還為神經(jīng)免疫調(diào)控在其他器官炎癥中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。研究團(tuán)隊(duì)表示，未來將進(jìn)一步探索神經(jīng)刺激療法在肝臟疾病中的應(yīng)用，特別是通過調(diào)控腦-肝軸來緩解肝臟炎癥和損傷。此外，研究團(tuán)隊(duì)還將深入研究TAFA2蛋白的作用機(jī)制，開發(fā)針對TAFA2-CCR2信號通路的靶向藥物，為肝臟疾病的治療提供更多選擇。
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豬不僅是重要的經(jīng)濟(jì)家畜，還在科研中扮演重要角色。豬器官與人類器官高度相似，被廣泛用于臨床前研究。
2020年，馬斯克展示了植入腦機(jī)芯片的豬，展示了腦電波信號的變化；2021年以來，全球已完成豬器官移植到腦死亡患者的實(shí)驗(yàn)；2025年，空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院又一次成功實(shí)施了豬肝臟異種移植到人腦死亡患者體內(nèi)，與之前不一樣的是，這次是切除人類肝臟后只保留豬肝臟，探討豬肝能否完全替代人肝。
從時空實(shí)驗(yàn)應(yīng)用條件看，豬的器官組織特征與人類接近，實(shí)驗(yàn)開發(fā)難度較低。豬是二倍體生物，基因組質(zhì)量良好，有基因表達(dá)調(diào)控?cái)?shù)據(jù)庫和單細(xì)胞數(shù)據(jù)，便于跨物種比較研究。綜上，時空技術(shù)的應(yīng)用可提升研究精度，為后續(xù)研究提供精準(zhǔn)參考。
生殖方向
1.豬早期卵子發(fā)生的時空圖譜
英文標(biāo)題：Spatiotemporal dynamics of early oogenesis in pigs
發(fā)表期刊：Genome Biology
影響因子：10.1
發(fā)布時間：2025-01
DOI：10.1186/s13059-024-03464-8
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時空部分：
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，豬E45、E55、E65、E75胚胎卵巢（n=2）。
空間轉(zhuǎn)錄組，豬E45、E55、E65、E75胚胎卵巢，10x Visium；E65胚胎卵巢，BMKMANU S1000。
百邁客生物為該研究提供了百創(chuàng)S1000空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)服務(wù)。
研究內(nèi)容總結(jié)：
① 該研究結(jié)合單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)(ST)探索在豬卵子發(fā)生早期卵巢微環(huán)境的空間組織，構(gòu)建時空基因表達(dá)譜。將卵子發(fā)生不同階段的生殖細(xì)胞簇投射到空間圖譜中，揭示了發(fā)育中的豬卵巢中生殖細(xì)胞的“皮質(zhì)-髓質(zhì)(C-M)”分布。豬和人之間的跨物種分析揭示了在卵子發(fā)生過程中生殖細(xì)胞的保守的C-M分布模式，提示豬可以作為人類早期卵子發(fā)生過程的理想研究模型。
② 利用ST數(shù)據(jù)進(jìn)行RNA速度分析，確定了豬卵巢皮質(zhì)和髓質(zhì)區(qū)顆粒細(xì)胞系的分子特征和空間動力學(xué)。通過空間共定位分析和細(xì)胞間通訊分析，揭示了皮質(zhì)和髓質(zhì)區(qū)域生殖細(xì)胞和體細(xì)胞之間獨(dú)特的細(xì)胞-細(xì)胞通訊模式。
③ 值得注意的是，卵巢組織的體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)細(xì)胞間NOTCH信號傳導(dǎo)和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白在啟動減數(shù)分裂和卵子形成程序中起關(guān)鍵作用，表明卵巢微環(huán)境對于生殖細(xì)胞的命運(yùn)調(diào)控起著重要作用。
圖1-基于Cell2location，使用scRNA-seq數(shù)據(jù)對ST數(shù)據(jù)進(jìn)行解卷積
2.時空技術(shù)解析豬滋養(yǎng)層類器官與母胎界面細(xì)胞多樣性
英文標(biāo)題：Defining Cellular Diversity at the Swine Maternal-Fetal Interface Using Spatial Transcriptomics and Organoids
發(fā)表期刊：bioRxiv
發(fā)布時間：2024-10
DOI：10.1101/2024.10.21.619461
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時空部分：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，滋養(yǎng)層細(xì)胞系類器官（n=3)?？臻g轉(zhuǎn)錄組：G65臍帶殘端附近1cm*1cm完整胎盤（包括母體和子代組織，n=4）。
研究內(nèi)容總結(jié)：
① 研究者使用足月豬胎盤構(gòu)建的sTO（豬滋養(yǎng)層類器官）可以擴(kuò)增、凍存并成功復(fù)蘇，高表達(dá)滋養(yǎng)層標(biāo)志基因KRT18、ELF3以及GATA3，與豬胎盤表達(dá)標(biāo)志更相似。此外，在人工基底膜中培養(yǎng)立刻形成懸浮培養(yǎng)可逆的局部頂面，通過和體內(nèi)較為一致的基因表達(dá)和細(xì)胞通訊程序分化成不同滋養(yǎng)層細(xì)胞。與當(dāng)前其他可用的體外模型相比，研究者開發(fā)的sTO是更理想的體外研究模型。
② 使用空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)定義妊娠中期豬母胎界面上滋養(yǎng)層原位轉(zhuǎn)錄組圖譜，無需依賴傳統(tǒng)標(biāo)志，揭示了豬子宮和胎盤的新marker，可用于精準(zhǔn)定義豬母胎界面組織學(xué)結(jié)構(gòu)；數(shù)據(jù)還包含以往未分析到的腺窩區(qū)（areola）和交界區(qū)，定義出3種腺窩細(xì)胞亞群，例如主要位于胎盤間質(zhì)附近而不明顯與交界區(qū)直接接觸的Areola-1。總之，該圖譜為后續(xù)豬生殖研究提供了基礎(chǔ)參考。
③ 空間數(shù)據(jù)可用于注釋sTO單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的細(xì)胞類型，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)sTO涵蓋了豬胎盤中滋養(yǎng)層細(xì)胞群的發(fā)育和功能差異，sTO和胎盤組織具有相同保守的關(guān)鍵信號通路。此外，由于sTO中有更多增殖干細(xì)胞，因而僅在sTO單細(xì)胞數(shù)據(jù)中觀察到增殖干細(xì)胞與其他滋養(yǎng)層間存在互作。總之，這些凸顯了sTO在研究豬胎盤發(fā)育中的用途。
圖2-空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)解析豬母胎界面的全局表達(dá)情況
3.豬竇卵泡的單細(xì)胞圖譜
英文標(biāo)題：Deciphering Cellular Heterogeneity and Communication Patterns in Porcine Antral Follicles by Single-Cell RNA Sequencing
發(fā)表期刊：Animals
發(fā)布時間：2023-09
DOI：10.3390/ani13193019
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時空部分：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組：D210母豬（取樣前48h內(nèi)注射5 IU PMSG）竇卵泡（n=2）。
研究內(nèi)容總結(jié)：
① 單細(xì)胞數(shù)據(jù)揭示了豬竇卵泡內(nèi)細(xì)胞的顯著異質(zhì)性，特別是顆粒細(xì)胞，研究者首次在豬中確認(rèn)壁顆粒細(xì)胞（mGC）和卵丘細(xì)胞（nGC）存在不同亞群，例如mGC1亞群在激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起到重要作用，而mGC2主要負(fù)責(zé)雌激素合成，cGC2負(fù)責(zé)糖酵解和卵丘擴(kuò)張，cGC1亞群具有mGC和cGC兩種顆粒細(xì)胞特征，表明卵泡內(nèi)存在多種狀態(tài)和功能的細(xì)胞。
圖3-豬竇狀卵泡中細(xì)胞的降維聚類結(jié)果
發(fā)育方向
4.豬皮膚早期發(fā)育的時空圖譜
英文標(biāo)題：Integrating Single-Cell and Spatial Transcriptomics Reveals Heterogeneity of Early Pig Skin Development and aSubpopulation with Hair Placode Formation
發(fā)表期刊：Advanced Science
影響因子：14.3
發(fā)布時間：2024-04
DOI：10.1002/advs.202306703
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時空部分：
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，E37胚胎（n=1，未知U），E41&E52&E85胚胎（每時期n=2，同窩有毛N、無毛H各1）。
空間轉(zhuǎn)錄組，E37胚胎（n=1），E41&E52&E85胚胎（每時期n=2，同窩有毛N、無毛H各1）。
研究內(nèi)容總結(jié)：
① 單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析得到7種主要細(xì)胞類型，空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析得到6種主要細(xì)胞類型，包括免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、施旺細(xì)胞等，且不同類型細(xì)胞空間分布與已知的皮膚組織解剖結(jié)構(gòu)相一致，相關(guān)性分析表明單細(xì)胞數(shù)據(jù)和空間數(shù)據(jù)中鑒定出的細(xì)胞類型一致性較高。
② 聯(lián)合已發(fā)表的人、小鼠皮膚單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)豬表皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞以及周細(xì)胞表達(dá)更多保守的特異性標(biāo)志基因，這些基因也與人類皮膚疾病相關(guān)，表明與小鼠相比，豬皮膚或許是一種更合適的人皮膚疾病研究模型。
③ 表皮細(xì)胞簇進(jìn)一步聚類得到9種亞型，OGN+/UCHL1+ 細(xì)胞主要在E37U中存在，毛囊間表皮（IFE）基底層細(xì)胞與祖細(xì)胞從E41到E52表現(xiàn)出增加趨勢。擬時序分析結(jié)果顯示存在兩種分化軌跡，OGN+/UCHL1+ 細(xì)胞—>IFE基底層細(xì)胞和真皮細(xì)胞前體（pre-DC）、OGN+/UCHL1+ 細(xì)胞—>成熟毛囊基底（Pc）發(fā)育和毛囊（HF）及角質(zhì)細(xì)胞分化。真皮成纖維細(xì)胞簇進(jìn)一步聚類得到乳頭狀成纖維細(xì)胞和網(wǎng)狀成纖維細(xì)胞，進(jìn)一步分析在E37U中鑒定出成纖維祖細(xì)胞。
④ 有毛豬中Pc的形成時期為E37-E41，無毛豬中缺乏Pc細(xì)胞。CytoTRACE、逆時序分析等結(jié)果表明，無毛豬OGN+/UCHL1+ 細(xì)胞增殖和遷移異常導(dǎo)致Pc不能正常形成，BMP和TGFβ是引起OGN+/UCHL1+ 細(xì)胞形成Pc的首個信號通路。
圖4-ST和scRNA-seq鑒定的常見細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄組之間具有高度一致性
5.豬出生后肝臟發(fā)育的單細(xì)胞動態(tài)圖譜
英文標(biāo)題：Single-cell dynamics of liver development in postnatal pigs
發(fā)表期刊：Science Bulletin
影響因子：18.8
發(fā)布時間：2023-09
DOI：10.1016/j.scib.2023.09.021
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時空部分：
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，出生后不同胎齡豬肝臟，D30(n = 3)，D42 (n = 3)，D150(n = 1)，D730(n = 2)。
單細(xì)胞核ATAC，D240(n=1)。
研究內(nèi)容總結(jié)：
① 構(gòu)建迄今最全面的出生后豬肝臟單細(xì)胞發(fā)育圖譜，涵蓋斷奶前（30天）、斷奶后（42天）、生長高峰（150天）和成年階段（730天）這四個生長發(fā)育重要階段，數(shù)據(jù)涵蓋單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組以及單細(xì)胞ATAC數(shù)據(jù)，共鑒定到23種細(xì)胞類型，包括肝臟中的三種稀有細(xì)胞類型，漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（pDCs），CAVIN3+IGF2+內(nèi)皮細(xì)胞和EBF1+成纖維細(xì)胞。
② 發(fā)現(xiàn)斷奶前仔豬和成年豬脂肪酸合成的差異，擬時序分析鑒定出5693個基因在三個發(fā)育階段表現(xiàn)出顯著表達(dá)水平變化，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)33個階段特異性轉(zhuǎn)錄因子，例如D30富集參與調(diào)節(jié)出生后肝細(xì)胞成熟的轉(zhuǎn)錄因子EZH2，D42富集參與調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律的CLOCK，還首次鑒定出成年豬肝竇內(nèi)皮特異性的轉(zhuǎn)錄因子LUAP2。通路富集分析結(jié)果顯示不同發(fā)育階段肝竇內(nèi)皮細(xì)胞富集的通路不同，D40是免疫相關(guān)通路富集，D730中主要是代謝相關(guān)通路基因表達(dá)上調(diào)。
③ 豬D30免疫細(xì)胞主要是NK（自然殺傷細(xì)胞）和T細(xì)胞，以往有報(bào)道表明新生小鼠免疫系統(tǒng)重髓系細(xì)胞占比更大，出生D30豬肝臟免疫系統(tǒng)可能發(fā)生了從髓系細(xì)胞到淋巴系細(xì)胞的免疫系統(tǒng)轉(zhuǎn)變。此外，豬trNK（組織駐留自然殺傷細(xì)胞）具有與人類相似的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)特征，或表明豬可以作為研究人trNK的理想模型。
圖5-單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）和單核RNA測序（snRNA-seq）鑒定發(fā)育中肝臟細(xì)胞類型
免疫方向
6.豬腎異種移植排異的時空圖譜
英文標(biāo)題：Spatiotemporal immune atlas of a clinicalgrade gene-edited pig-to-human kidney xenotransplant
發(fā)表期刊：Nature Communications
影響因子：14.7
發(fā)布時間：2024-04
DOI：10.1038/s41467-024-47454-7
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時空部分：
單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組，移植前豬腎穿刺組織，移植后24h/72h/74h豬腎穿刺組織（n=4）。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，移植74h后切除的腎組織CD45+細(xì)胞（n=1）；
空間轉(zhuǎn)錄組，移植前豬腎穿刺組織，移植后24h/72h/74h豬腎穿刺組織（n=4）。
研究內(nèi)容總結(jié)：
① 基因編輯豬腎移植給腦死亡且雙腎切除患者。數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，未在異種移植后的豬腎組織中發(fā)現(xiàn)急性細(xì)胞排異或IgM/IgG/配體蛋白結(jié)合的證據(jù)，但發(fā)現(xiàn)急性腎小管壞死和病因不明的血栓性微血管病變。
② 移植后豬腎中髓系細(xì)胞是人和豬腎中檢測到的最多的免疫細(xì)胞，移植3天內(nèi)人B細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞很少檢測到，3天后檢測到的人免疫細(xì)胞增多但豐度遠(yuǎn)小于豬免疫細(xì)胞。
③ 移植3天后發(fā)現(xiàn)人類中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞主要與豬內(nèi)皮細(xì)胞共定位，人巨噬細(xì)胞主要與豬基質(zhì)細(xì)胞共定位，表明人免疫細(xì)胞對豬腎皮質(zhì)浸潤有限。
④ 移植豬腎中人和豬巨噬細(xì)胞更傾向于激活抗炎癥基因表達(dá)。
圖6-人髓系細(xì)胞對豬腎異種移植的有限浸潤
7.豬空腸免疫細(xì)胞單細(xì)胞圖譜
?
英文標(biāo)題：Single-Cell Transcriptional Analysis of Lamina Propria Lymphocytes in the Jejunum Reveals Innate Lymphoid Celllike Cells in Pigs
發(fā)表期刊：The Journal of Immunology
發(fā)布時間：2024-01
DOI：10.4049/jimmunol.2300463
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時空部分：
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，4周大仔豬，空腸固有層淋巴細(xì)胞（n=3），空腸先天淋巴樣細(xì)胞（n=3）。
研究內(nèi)容總結(jié)：
② 豬空腸ILC標(biāo)志基因與人基因相似，包括IL-23R、AHR、NCR2等。此外，研究者發(fā)現(xiàn)ILC3可能分化成ILC2、ILC1和NK細(xì)胞。ILC3亞群種，ILC3b沒有明顯高表達(dá)基因，是ILC亞群中具有更高轉(zhuǎn)分化可塑性的亞群，IKZF1和TGFB1可能與該過程有關(guān)。
③ 豬ILC3表達(dá)TAC3基因，該基因編碼蛋白的受體是NK3R，可以促進(jìn)釋放促性腺激素釋放激素，繼而促進(jìn)性激素釋放，因此TAC3在促性腺激素軸上起到重要作用，因而可能存在腸/性腺軸，暗示豬腸道ILC3或調(diào)控性腺發(fā)育。
圖7-豬空腸中l(wèi)LC3s的分型研究
8.感染PEDV仔豬的空腸單細(xì)胞圖譜
?
英文標(biāo)題：Identification of Cell Types and Transcriptome Landscapes of Porcine Epidemic Diarrhea VirusInfected Porcine Small Intestine Using Single-Cell RNA Sequencing
發(fā)表期刊：The Journal of Immunology
發(fā)布時間：2023-02
DOI：10.4049/jimmunol.2101216
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時空部分：
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，口服2ml PEDV-24h的3天大仔豬（n=1,4只豬樣本混合），口服對照液體-24h的3天大仔豬（n=1,4只豬樣本混合）
研究內(nèi)容總結(jié)：
① 首次繪制感染PEDV（豬流行性腹瀉病毒）的仔豬小腸單細(xì)胞圖譜，使用人小腸細(xì)胞類型marker鑒定出12種細(xì)胞類型，發(fā)現(xiàn)豬小腸tuft細(xì)胞新特異性標(biāo)志基因DNAH11，結(jié)果表明多數(shù)人小腸特異性marker也可以用到豬研究中。此外，豬小腸Th17細(xì)胞（3和9簇）特異性高表達(dá)IL17A、IL7F和IL22，但不高表達(dá)T細(xì)胞代表性CD3，這可能與豬T細(xì)胞分化有關(guān)。
② 抗菌肽（AMP）相關(guān)基因分析結(jié)果顯示，僅DEFB115和REG3G在仔豬空腸部分的腸細(xì)胞中最為豐富，PEDV感染會導(dǎo)致REG3G顯著上調(diào)。REG3G表達(dá)與IL33、MyD88、STAT3等相關(guān)，在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)感染PEDV后IPEC-J2細(xì)胞IL33表達(dá)水平以及STAT3磷酸化水平顯著增加，表明IL33-STAT3信號通路可能在PEDV感染誘導(dǎo)的REG2G表達(dá)中起到重要作用。
③ 功能富集分析結(jié)果顯示，病毒感染導(dǎo)杯狀細(xì)胞、tuft細(xì)胞和腸內(nèi)分泌細(xì)胞中緊密連接和粘附連接通路水平顯著降低，體外實(shí)驗(yàn)確認(rèn)PEDV感染的IPEC-J2細(xì)胞中，緊密連接通路相關(guān)基因表達(dá)顯著降低，但感染晚期粘附連接通路相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平表達(dá)顯著增加，這可能是由于不同腸細(xì)胞類型對PEDV感染的不同響應(yīng)導(dǎo)致的。冠狀病毒受體分析結(jié)果表明，豬小腸上皮細(xì)胞高表達(dá)多種不同的冠狀面病毒受體，這一發(fā)現(xiàn)支持豬易受冠狀病毒感染并表現(xiàn)感染相關(guān)腸道癥狀。
圖8-豬小腸空腸段細(xì)胞類型的測定
同源器官比較
9.脊椎動物肺單細(xì)胞圖譜
英文標(biāo)題：Origin and stepwise evolution of vertebrate lungs
發(fā)表期刊：Nature ecology & evolution
影響因子：14.1
發(fā)布時間：2025-2
DOI：10.1038/s41559-025-02642-6
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時空部分：
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序：
塞內(nèi)加爾多鰭魚，肺（n=2），腦/食管/鰓/心臟/腸/肌肉/胃（各器官，n=1）；
非洲肺魚，肺（n=2），腦/食管/鰓/心臟/腸/腎/肌肉/皮膚/胃（各器官，n=1）；
條紋斑竹鯊，壺腹/魚鰭/心臟/腸/胰腺/鰓/牙（各器官，n=3），腦/食管/腎（各器官，n=2），脾臟（n=6），眼睛（n=1）；雞肺，E6/E7/P3（各時期，n=1）；
非洲牛蛙肺（n=2）；鬃獅蜥肺（n=1）。
人/小鼠/大鼠/豬的肺數(shù)據(jù)使用已有的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)。
百邁客生物為塞內(nèi)加爾多鰭魚和非洲肺魚除肺以外的組織，提供了百創(chuàng)DG1000單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)。
研究內(nèi)容總結(jié)：
① 使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分析9種動物的成體/胚胎肺組織及其他組織，發(fā)現(xiàn)軟骨魚具有多個肺發(fā)育所必須得遺傳組分，包括肺特異性基因，但不同物種中這些基因的表達(dá)模式和功能可能有差異，表明軟骨魚距離擁有肺在“進(jìn)化上只差一步之遙”；軟骨魚食管和胃中，少量細(xì)胞共表達(dá)對呼吸脊椎動物肺功能十分重要的sftpb和abca3基因，暗示頜類脊椎動物最近共同祖先（LCA）經(jīng)歷顯著的演化變化，不僅發(fā)育出重要特征如頜和成對附件，還為肺最終出現(xiàn)奠定基礎(chǔ)。
② 許多保守的非編碼組分（CNE）來源于頜類脊椎動物祖先，暗示肺的遺傳基礎(chǔ)可能在脊椎動物演化很早就出現(xiàn)，但無肺蠑螈中缺失的CNE與其促肺活性無關(guān)，表明這些組分可能還具有除肺發(fā)育以外的多種功能；硬骨魚祖先來源的CNE在無肺蠑螈表現(xiàn)出更高的丟失率，也反映出這些CNE具有顯著的肺功能特異性，強(qiáng)調(diào)了復(fù)雜器官起源中調(diào)控組分演化的重要性。這些證據(jù)暗示肺起源的兩個階段過程，最開始頜類脊椎動物L(fēng)CA出現(xiàn)基礎(chǔ)的肺相關(guān)遺傳組分，隨后譜系演化出更特異性的肺增強(qiáng)子產(chǎn)生硬骨魚；功能完全的肺可能在軟骨魚和硬骨魚譜系分開后演化而來。
③ 全基因組復(fù)制對肺演化很重要，1866個肺相關(guān)直系同源基因中有776個是脊椎動物兩輪全基因組復(fù)制（2R-WGD）的產(chǎn)物；哺乳動物譜系特異的基因復(fù)制也十分重要，sfta2-/-小鼠表現(xiàn)出明顯的呼吸疾病，包括顯著的炎癥。
④ 研究成果支持了兩個關(guān)于復(fù)雜器官的前期假設(shè)。首先，肺進(jìn)化是一個逐步過程，與達(dá)爾文預(yù)測相一致，與眼睛和其他器官類似，肺演化似乎是隨時間逐漸發(fā)生的。其次，反映了Jacob定律，即演化類似“修補(bǔ)匠”，使用已有的遺傳基礎(chǔ)，包括招募、征用已經(jīng)存在的基因和調(diào)控組分?？傊?，這些結(jié)果表明調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的修改對肺的起源和演化是十分重要的，新基因或基因重復(fù)的出現(xiàn)提供了基礎(chǔ)材料，即使這些基因并不會立刻發(fā)揮作用。
10.野豬/萊蕪豬/杜洛克豬新生骨骼肌單細(xì)胞圖譜
英文標(biāo)題：Single-Cell RNA-Sequencing Provides Insight into Skeletal Muscle Evolution during the Selection of Muscle Characteristics
發(fā)表期刊：Advanced Science
影響因子：14.3
發(fā)布時間：2023-10
研究內(nèi)容總結(jié)：
① 使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)繪制了野豬、萊蕪豬和杜洛克豬新生骨骼肌駐留細(xì)胞圖譜，鑒定出9種細(xì)胞類型，包括成肌細(xì)胞、肌細(xì)胞、衛(wèi)星細(xì)胞等，定義兩種新亞型，MT豐富FAP（?bro-adipogenic progenitors）以及肌細(xì)胞樣FAP。
② 與不同物種的胎兒和成體骨骼肌相比，豬新生骨骼肌細(xì)胞組成類型更豐富。例如，豬新生骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞不僅包含衛(wèi)星干細(xì)胞（PAX7+），還包括兩個有不同肌源性潛能的亞群（HES1+和TRIB1+衛(wèi)星細(xì)胞）；少有研究可解答骨骼肌中FAP的異質(zhì)性，但本研究發(fā)現(xiàn)4種FAP亞群。與人、小鼠骨骼肌數(shù)據(jù)聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)豬骨骼肌駐留細(xì)胞的通用marker和物種特異性的marker。
③ 豬新生骨骼肌中發(fā)現(xiàn)增殖分化活性狀態(tài)的干性樣細(xì)胞，如pro-NK/T、間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）、間質(zhì)細(xì)胞等，且MSC和FAP間存在一群具有典型標(biāo)志基因如CD73、CD90和PDGFRA的連續(xù)態(tài)細(xì)胞亞群。此外，擬時序分析揭示杜洛克豬新生骨骼肌中的成肌譜系干細(xì)胞處于初始階段，野豬的成肌譜系已處于分化末期和成熟期，萊蕪豬位于中間態(tài)。
④ 不同品種豬具有不同骨骼肌表型，它們骨骼肌駐留細(xì)胞譜系存在一定差異。與家豬相比，野豬缺少兩種FAP亞群，但存在THY1+衛(wèi)星細(xì)胞；發(fā)現(xiàn)品種特異性細(xì)胞類型，例如萊蕪豬具有COL13A1+ 腱細(xì)胞；與萊蕪豬和野豬相比，杜洛克豬新生肌肉中具有更多增殖的前體脂肪細(xì)胞，或意味杜洛克豬未來選育后可積累更高的IMF（肌內(nèi)脂肪）。
圖9-野豬、萊蕪豬和杜洛克豬骨骼肌細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜分析
11.人/小鼠/大鼠/豬胃竇跨物種比較單細(xì)胞圖譜
英文標(biāo)題：Cross-species single-cell transcriptomic analysis of animal gastric antrum reveals intense porcine mucosal immunity
發(fā)表期刊：Cell Regeneration
發(fā)布時間：2023-08
DOI：10.1186/s13619-023-00171-w
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時空部分：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，人（n=4），小鼠（n=3），大鼠（n=3），豬（n=3）。
研究內(nèi)容總結(jié)：
① 使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)構(gòu)建人、豬、大鼠和小鼠的胃竇單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，鑒定出9種類型的細(xì)胞，包括小凹黏膜細(xì)胞、小凹祖細(xì)胞、基底腺粘液細(xì)胞等。絕大多數(shù)類型的細(xì)胞存在于兩個或者多個物種中，F(xiàn)3和CLCA1低表達(dá)水平的祖細(xì)胞僅在人類和豬的胃竇上皮中發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)F3的基底粘液腺細(xì)胞僅在豬胃竇上皮中發(fā)現(xiàn)，通路富集分析表明F3+細(xì)胞類群可能與細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖以及蛋白穩(wěn)定維持相關(guān)。
② 功能富集分析結(jié)果表明，人的胃竇上皮高表達(dá)金屬離子穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因，豬的胃竇上皮高表達(dá)免疫相關(guān)基因，大鼠和小鼠的胃竇上皮高表達(dá)脂代謝相關(guān)基因，這種差異可能是由于飲食習(xí)慣導(dǎo)致的。豬胃竇上皮類器官bulk RNA-seq數(shù)據(jù)也確認(rèn)這一發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步的豬胃竇上皮細(xì)胞類器官體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TNFα能夠特異性地上調(diào)T細(xì)胞和B細(xì)胞活化相關(guān)基因，這些結(jié)果表明，正常生理狀態(tài)下豬胃竇上皮細(xì)胞具有強(qiáng)免疫能力，可能與其復(fù)雜飲食習(xí)慣和居住環(huán)境有關(guān)。
③ 進(jìn)一步分析人和豬胃竇中的免疫細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)人胃竇免疫細(xì)胞高表達(dá)B細(xì)胞/T細(xì)胞激活和功能相關(guān)基因，而豬胃竇顯著高表達(dá)B細(xì)胞/T細(xì)胞細(xì)胞增殖相關(guān)基因；細(xì)胞通訊分析結(jié)果顯示，人胃竇中上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞間高表達(dá)或特異性表達(dá)免疫細(xì)胞產(chǎn)生、成熟、維持和功能相關(guān)受配體對，而豬中主要是與上皮細(xì)胞生長分化、抗炎癥和抗菌、免疫細(xì)胞增殖相關(guān)。
圖10-scRNA-seq分析揭示了人、豬大鼠和小鼠胃竇細(xì)胞組成及基因表達(dá)譜
基礎(chǔ)圖譜
12.豬器官全景單細(xì)胞圖譜
英文標(biāo)題：Endothelial cell heterogeneity and microglia regulons revealed by a pig cell landscape at single-cell level
發(fā)表期刊：Nature Communications
影響因子：14.7
發(fā)布時間：2022-06
DOI：10.1038/s41467-022-31388-z
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時空部分：
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，6個月大豬，肝（n=1），血液PBMC（n=1），視網(wǎng)膜（n=1），脾臟（n=1），腸道（n=1），肺（n=1），脂肪組織（n=2）。
單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組，6個月大豬，腦（n=9），視網(wǎng)膜（n=1)，腎臟（n=1），心臟（n=1），脾臟（n=1），肝臟（n=1），肺（n=1）。
研究內(nèi)容總結(jié)：
① 使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序及單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測序，構(gòu)建首個家豬多器官單細(xì)胞圖譜，得到234種降維聚類簇，鑒定出58種細(xì)胞類型及其相關(guān)的顯著富集標(biāo)志基因，搭建了可視化家豬單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（Pig Single Cell Atlas Database）。
② 對血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析，鑒定出21種具有特異表達(dá)特征和功能的血管內(nèi)皮細(xì)胞類型，包括脂肪組織中依賴于TGF-b2信號通路內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化亞型；人/豬肝臟、腎臟和心臟組織中，內(nèi)皮細(xì)胞主要通過VEGF、PDGF，TGF-β和BMP通路與其他細(xì)胞類型互作，但不同細(xì)胞類型的互作通路有差異，例如豬內(nèi)皮細(xì)胞可與肝臟免疫細(xì)胞、心臟所有細(xì)胞細(xì)胞類型通過PDGF交流，但在腎臟中可通過PDGF通路與內(nèi)皮細(xì)胞交流的僅有足細(xì)胞。總之，這些結(jié)果表明家豬單細(xì)胞圖譜為研究豬或人組織中細(xì)胞間互作提供了有參考價值的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
③ 對家豬、人、小鼠、猴、倉鼠、栗鼠、鼴鼠等13個物種的大腦小膠質(zhì)細(xì)胞單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)1590個保守的轉(zhuǎn)錄組因子（TF）靶向?qū)?，其中MEF2C、SPI1、IRF8、ZFP36L1在13個物種的小膠質(zhì)細(xì)胞中均高表達(dá)，這些結(jié)果表明家豬單細(xì)胞圖譜為研究不同物種小膠質(zhì)細(xì)胞保守和差異的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對未來腦小膠質(zhì)細(xì)胞功能研究發(fā)展具有重要意義。
圖11-豬20種組織單細(xì)胞圖譜
從以上文章可以看到，豬相關(guān)研究除了養(yǎng)殖、繁育、品種優(yōu)化、營養(yǎng)學(xué)、表型性狀、遺傳演化等方面，生殖、發(fā)育、衰老、損傷與修復(fù)、異種移植、神經(jīng)學(xué)等方向研究成果也具有較高參考和轉(zhuǎn)化價值。未來，可能會出現(xiàn)豬睪丸、胚胎發(fā)育、心血管組織、腦組織、疾病模型、異種移植/同種異體移植、鼻嗅覺、舌味覺、免疫系統(tǒng)等方向的研究成果。
Ps：關(guān)注時空組學(xué)在豬領(lǐng)域研究請聯(lián)系當(dāng)?shù)貥I(yè)務(wù)經(jīng)理獲取原文~
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]]>近年來，光合作用作為植物生命活動的核心環(huán)節(jié)，與糧食安全、能源開發(fā)及氣候變化等全球性挑戰(zhàn)密切相關(guān)，備受科學(xué)界和行業(yè)的高度關(guān)注。時空組學(xué)技術(shù)是近年來比較火熱的技術(shù)之一，在植物領(lǐng)域的應(yīng)用廣泛且深入，該技術(shù)通過同時獲取細(xì)胞的空間位置信息和基因表達(dá)數(shù)據(jù)，為理解植物組織生長發(fā)育、生理生化、抗逆應(yīng)激、生物進(jìn)化等多個方面提供了重要的研究手段。
于是，我問DeepSeek：植物如何利用時空組學(xué)進(jìn)行光合作用研究？
植物利用時空組學(xué)（Spatio-Temporomics）研究光合作用，主要通過整合空間組學(xué)（空間分辨的分子數(shù)據(jù)）和時間組學(xué)（動態(tài)變化的分子數(shù)據(jù)），揭示光合作用相關(guān)基因、蛋白質(zhì)、代謝物等在時間和空間上的協(xié)同調(diào)控機(jī)制。以下是具體研究方向和技術(shù)的應(yīng)用：1.空間組學(xué)解析光合作用的細(xì)胞/組織異質(zhì)性
- 空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)：
利用單細(xì)胞或空間分辨轉(zhuǎn)錄組技術(shù)（如10x Genomics Visium、MERFISH），定位光合作用相關(guān)基因（如編碼光系統(tǒng)蛋白的基因、卡爾文循環(huán)酶基因）在葉片不同細(xì)胞類型（葉肉細(xì)胞、維管束鞘細(xì)胞）或不同組織區(qū)域的表達(dá)差異。例如，C4植物中光合基因在葉肉細(xì)胞和維管束鞘細(xì)胞中的空間特異性表達(dá)。
- 空間蛋白質(zhì)組學(xué)：
通過質(zhì)譜成像（MALDI-MSI）或熒光標(biāo)記技術(shù)，研究光合作用關(guān)鍵蛋白（如Rubisco、PSII復(fù)合體）在葉綠體基質(zhì)、類囊體膜等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的分布，以及光強(qiáng)變化對蛋白定位的影響。
- 空間代謝組學(xué)：
分析光合中間產(chǎn)物（如ATP、NADPH、蔗糖）在葉片不同區(qū)域的動態(tài)積累，揭示光合同化產(chǎn)物（如淀粉、糖）的運(yùn)輸與分配機(jī)制。
2.時間組學(xué)揭示光合作用的動態(tài)調(diào)控
- 晝夜節(jié)律與光響應(yīng)：
通過時間序列轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，研究光合作用基因（如LHCB、PIFs）在晝夜周期中的表達(dá)波動，以及光信號（如紅光、藍(lán)光）如何通過生物鐘調(diào)控光合效率。
- 發(fā)育階段動態(tài)：
比較幼苗、成熟葉、衰老葉中光合相關(guān)基因的時序表達(dá)模式，揭示葉綠體發(fā)育（如原質(zhì)體分化）和衰老過程中光合能力的動態(tài)變化。
- 環(huán)境脅迫響應(yīng)：
分析高溫、干旱或高光脅迫下，植物光合作用相關(guān)基因和代謝物的短期（分鐘級）和長期（數(shù)天）響應(yīng)，例如光保護(hù)機(jī)制（非光化學(xué)淬滅，NPQ）的動態(tài)調(diào)控。
3.時空整合解析光合作用的協(xié)同網(wǎng)絡(luò)
- 多組學(xué)整合：
結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組數(shù)據(jù)，構(gòu)建光合作用基因-酶-代謝物的時空調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。例如，光合同化產(chǎn)物（如蔗糖）的輸出如何與維管組織發(fā)育相關(guān)聯(lián)。
- 細(xì)胞間通訊研究：
利用空間組學(xué)數(shù)據(jù)，分析葉肉細(xì)胞與維管束鞘細(xì)胞之間的代謝物交換（如C4植物的CO2濃縮機(jī)制），或共生微生物（如固氮菌）如何影響宿主光合作用。
- 3D時空建模：
通過計(jì)算模型模擬葉片中光梯度、CO2擴(kuò)散與光合基因表達(dá)的空間耦合關(guān)系，預(yù)測最優(yōu)光合效率的葉片結(jié)構(gòu)。
4.應(yīng)用場景與案例
- C3與C4植物比較：
時空組學(xué)可揭示C4植物光合細(xì)胞分工（Kranz結(jié)構(gòu)）的進(jìn)化機(jī)制，例如PEP羧化酶在維管束鞘細(xì)胞中的特異性表達(dá)。
- 作物改良：
通過篩選光合效率時空差異的基因（如調(diào)控氣孔開閉的基因），設(shè)計(jì)高光效作物品種。
- 極端環(huán)境適應(yīng)：
研究荒漠植物（如仙人掌）如何在干旱條件下時空調(diào)控光合相關(guān)基因，減少水分流失。
5.技術(shù)挑戰(zhàn)與未來方向
- 技術(shù)限制：
當(dāng)前空間組學(xué)分辨率（單細(xì)胞/亞細(xì)胞級別）和通量仍需提升，尤其是葉綠體內(nèi)分子動態(tài)的實(shí)時監(jiān)測。
- C3與C4植物比較：
跨尺度（分子-細(xì)胞-組織）和多組學(xué)數(shù)據(jù)的整合分析需要更強(qiáng)大的算法支持。
- 活體動態(tài)監(jiān)測：
開發(fā)非侵入式成像技術(shù)（如熒光報(bào)告系統(tǒng)），實(shí)時追蹤光合作用相關(guān)分子的時空動態(tài)。
DeepSeek提到的當(dāng)前空間組學(xué)分辨率（單細(xì)胞/亞細(xì)胞級別）和通量的限制，百邁客生物已經(jīng)進(jìn)行了優(yōu)化提升，推出了百創(chuàng)S3000空間轉(zhuǎn)錄組芯片（捕獲區(qū)面積：6.8*6.8mm2，相鄰兩個捕獲位點(diǎn)的中心距為3.5μm）。該芯片具有高基因捕獲效率，搭配植物多尺度細(xì)胞分割技術(shù)，部分植物組織單個細(xì)胞中位基因數(shù)可達(dá)1000+，基因捕獲能力媲美單細(xì)胞測序。
關(guān)于應(yīng)用方向場景案例，DeepSeek究竟說的對不對？
我們還需要結(jié)合已發(fā)表的文獻(xiàn)看一看，于是小編又下載盤點(diǎn)了7篇植物光合作用方向的時空組學(xué)文章，這些成果發(fā)表期刊有Nature(IF=50.5)與預(yù)印本系統(tǒng)bioRxiv。研究的物種涉及水稻、高粱、玉米、狗尾草、黍、冰葉日中花、Urochloa fusca、堇娘芥等，涉及組織部位主要是幼苗葉片、葉原基等。
接下來，我們一起來看看植物光合作用方向的時空組學(xué)應(yīng)用進(jìn)展吧！
1.祖先細(xì)胞身份網(wǎng)絡(luò)的擴(kuò)展驅(qū)動C4光合作用的進(jìn)化
英文標(biāo)題：Exaptation of ancestral cell-identity networks enables C4?photosynthesis發(fā)表期刊：Nature
影響因子：50.5
物種樣本：水稻（Oryza sativa，C3植物）、高粱（Sorghum bicolor，C4植物）
測序策略：單細(xì)胞核RNA測序、單細(xì)胞核多組學(xué)測序、高分辨率sci-RNA-seq3技術(shù)
DOI：https://doi.org/10.1038/s41586-024-08204-3
發(fā)表時間：2024.11.20
取樣策略：
單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組：水稻和高粱幼苗暗生長5天后，在光周期（12h光/12h暗）中采集0h（暗）、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、48h共9個時間點(diǎn)的地上組織?？傆?jì)水稻190,569個核、高粱265,701個核。
圖1-水稻和高粱單細(xì)胞測序取樣過程示意圖
① 地球上大多數(shù)高產(chǎn)植物通過C4途徑進(jìn)行光合作用，相較于原始的C3途徑，C4途徑的光合效率提高了50%。維管束鞘細(xì)胞在激活光合作用中扮演了關(guān)鍵角色。然而，維管束鞘細(xì)胞如何執(zhí)行光合調(diào)控功能尚不明確。
② 該研究通過單細(xì)胞RNA測序(sc-RNAseq)和單細(xì)胞轉(zhuǎn)座酶可及性染色質(zhì)測序(sc-ATACseq)，揭示了C4葉片中維管束鞘細(xì)胞基因表達(dá)的變化與C3葉片中已知的順式調(diào)控元件相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在C3植物水稻和C4植物高粱中，DOF motif在維管束鞘細(xì)胞中定位，并能調(diào)控光合作用的發(fā)展。在高粱中，大多數(shù)受光合作用調(diào)控的高表達(dá)基因都受到DOF motif的調(diào)控。這些轉(zhuǎn)錄因子在不同細(xì)胞間穩(wěn)定表達(dá)，并能在C3和C4植物葉片的維管束鞘細(xì)胞中激活光合作用。
③ 該研究結(jié)果為理解復(fù)雜的C4途徑進(jìn)化提供了分子層面的見解，并為指導(dǎo)C3和C4作物的生長發(fā)育提供了理論基礎(chǔ)。
圖2-水稻和高粱幼苗去黃化過程中單細(xì)胞核的基因表達(dá)和染色質(zhì)可及性
2.禾本科植物單細(xì)胞分辨率下C3與C4光合作用順式調(diào)控基礎(chǔ)研究
英文標(biāo)題：Investigating the cis-Regulatory Basis of?C3?and?C4?Photosynthesis in Grasses at Single-Cell Resolution發(fā)表期刊：bioRxiv
物種樣本：C4植物：玉米（Zea mays，NADP-ME型）、高粱（Sorghum bicolor，NADP-ME型）、黍（Panicum miliaceum，NAD-ME型）、Browntop Signalgrass（Urochloa fusca，PEPCK型）；對照C3植物：水稻（Oryza sativa）
測序策略：sciATAC-seq
DOI：https://doi.org/10.1101/2024.01.05.574340
發(fā)布時間：2024.01.05
取樣策略：
發(fā)育階段：C4物種取第三葉展開期葉片，C3水稻取18天齡葉片；
技術(shù)重復(fù)：每個物種設(shè)置生物學(xué)重復(fù)，總計(jì)玉米16,060核、高粱15,301核、黍7,081核、Browntop Signalgrass共19,110核、水稻5,952核。
① 盡管關(guān)于C4光合作用關(guān)鍵酶的研究已經(jīng)有了相當(dāng)多的認(rèn)識，但對于在特定細(xì)胞類型中指定其表達(dá)的重要順式調(diào)控機(jī)制（cis-regulation）的了解卻少之又少。
② 該研究使用單細(xì)胞sci-ATAC-seq來鑒定與C4酶相關(guān)的特異細(xì)胞類型的可及染色質(zhì)區(qū)域（ACRs），研究涵蓋了五種不同的禾本科植物，包括四種C4植物和一種C3植物。其中，C4植物分屬三種不同的光合亞型：玉米（Zea mays）和高粱（Sorghum bicolor）屬于NADP-ME亞型；黍（Panicum miliaceum）屬于NAD-ME亞型；Urochloa fusca屬于PEPCK亞型；C3植物水稻（Oryza sativa）
③ 該研究繪制了所有C4植物中必需酶和各C4亞型特有酶的cis-調(diào)控圖譜，并使用染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)測量C4酶的特定細(xì)胞類型偏好。將這些數(shù)據(jù)與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)相結(jié)合，揭示了物種間基因家族成員的多樣化共選擇，展示了C4進(jìn)化的不同路徑。除了啟動子近端ACRs，研究發(fā)現(xiàn)C4基因平均每個都有兩到三個遠(yuǎn)端特異性細(xì)胞類型的ACRs，這突出了C4進(jìn)化的復(fù)雜性和多樣性。在研究這些特異性細(xì)胞類型ACRs的進(jìn)化歷史時，發(fā)現(xiàn)即使在密切相關(guān)的物種中，也存在從保守到新穎的ACRs光譜，表明這些C4位點(diǎn)的順式調(diào)控正在持續(xù)進(jìn)化。
④ 該研究揭示了C4光合作用關(guān)鍵基因位點(diǎn)的順式調(diào)控進(jìn)化動態(tài)和復(fù)雜性，尤其強(qiáng)調(diào)了這些位點(diǎn)的精細(xì)化順式調(diào)控進(jìn)化。研究成果為未來進(jìn)一步探索提供了重要資源，可能有助于在氣候變化條件下優(yōu)化C3作物的性能。
圖3-在單細(xì)胞分辨率下對不同作物的細(xì)胞類型注釋
3.單細(xì)胞分辨率下冰葉日中花CAM誘導(dǎo)的葉肉特異性晝夜動態(tài)
英文標(biāo)題：Mesophyll-Specific Circadian Dynamics of CAM Induction in the Ice Plant Unveiled by Single-Cell Transcriptomics發(fā)表期刊：bioRxiv
物種樣本：冰葉日中花（Mesembryanthemum crystallinum，兼性CAM植物）
測序策略：單細(xì)胞核RNA測序、Iso-Seq全長轉(zhuǎn)錄組測序、基因組組裝
DOI：https://doi.org/10.1101/2024.01.05.574430
發(fā)布時間：2024.01.05
取樣策略：
處理?xiàng)l件：鹽脅迫組：5周齡植株經(jīng)0.5M NaCl處理8天；
對照組：正常灌溉植株；
時間點(diǎn)：光周期（12h光/12h暗）中采集黎明（Dawn）和黃昏（Dusk）樣本，鹽處理組與對照組各取2個時間點(diǎn)，共4組樣本的葉片；
單細(xì)胞核測序：共獲取17,994個高質(zhì)量核，注釋17個細(xì)胞簇，覆蓋葉肉（海綿/柵欄）、表皮、保衛(wèi)細(xì)胞、木質(zhì)部、韌皮部等
① 景天酸代謝（Crassulacean acid metabolism, CAM）是C3光合作用二氧化碳固定途徑的一個進(jìn)化改良形式，大約有7%的陸生植物通過這種方式適應(yīng)干旱環(huán)境?？烧T導(dǎo)型CAM植物，例如冰葉日中花（Mesembryanthemum crystallinum，普通冰草），擁有一種獨(dú)特的能力，能夠在高鹽度和水分不足的脅迫下從C3光合作用切換到CAM光合作用。
② 該研究通過單核RNA測序（snRNA-seq），結(jié)合一個全新高質(zhì)量組裝和注釋的基因組，對冰草從C3到CAM的環(huán)境誘導(dǎo)轉(zhuǎn)變進(jìn)行了表征，以識別其潛在的調(diào)控因子。針對在黎明和黃昏采集的冰草葉片在C3和CAM切換過程中單核RNA測序數(shù)據(jù)的分析，揭示了在CAM誘導(dǎo)初期葉肉細(xì)胞中存在顯著的轉(zhuǎn)錄變化。
③ 值得注意的是，該研究發(fā)現(xiàn)標(biāo)明了黃昏時參與CAM或C3光合作用的不同葉肉亞細(xì)胞類型。細(xì)胞軌跡推斷分析重建了全天候（24小時）的CAM和C3周期，直接比較了兩條途徑中的基因表達(dá)譜。這項(xiàng)對比研究揭示了CAM和C3細(xì)胞軌跡中關(guān)鍵晝夜節(jié)律基因的不同表達(dá)模式，表明晝夜節(jié)律調(diào)控與CAM的誘導(dǎo)之間存在聯(lián)系。
圖4-所有四個snRNAseq數(shù)據(jù)集的UMAP聚類
4.植物細(xì)胞類型特異性順式調(diào)節(jié)元件的進(jìn)化
英文標(biāo)題：Evolution of plant cell-type-specific?cis-regulatory elements發(fā)表期刊：bioRxiv
物種樣本：核心物種：水稻（Oryza sativa，C3植物）
比較物種：玉米（Zea mays）、高粱（Sorghum bicolor）、黍（Panicum miliaceum）、Urochloa fusca
測序策略：單細(xì)胞ATAC測序、空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（Slide-Seq V2）、Iso-Seq全長轉(zhuǎn)錄組測序
DOI：https://doi.org/10.1101/2024.01.08.574753
發(fā)布時間：2024.01.08
取樣策略：
單細(xì)胞ATAC測序：水稻：葉、根、種子、穗等9個器官；發(fā)育階段：葉原基（P3-P6）、成熟葉（V4階段）；其他物種：玉米、高粱、黍、Browntop Signalgrass
空間轉(zhuǎn)錄組：水稻根
① Cis調(diào)控元件（Cis-regulatory elements, CREs）在基因表達(dá)調(diào)控中至關(guān)重要，但其進(jìn)化機(jī)制的理解仍然具有挑戰(zhàn)性。
② 該研究構(gòu)建了一個全面的水稻（Oryza sativa）染色質(zhì)可及性單細(xì)胞圖譜，整合了來自103,911個細(xì)胞核、代表126種離散細(xì)胞狀態(tài)的九個不同器官的數(shù)據(jù)。通過比較基因組學(xué)，分析了水稻與另外四種禾本科植物（玉米?Zea mays、高粱?Sorghum bicolor、黍?Panicum miliaceum?和?Urochloa fusca）中57,552個細(xì)胞核的細(xì)胞類型分辨染色質(zhì)可及性之間的差異。
③ 研究發(fā)現(xiàn)，可及染色質(zhì)區(qū)域（Accessible Chromatin Regions, ACRs）的保守性水平因細(xì)胞類型特異性程度的不同而有所區(qū)別。還發(fā)現(xiàn)ACRs、保守的非編碼序列、細(xì)胞類型特異性、保守性和組織特異性切換之間存在復(fù)雜關(guān)系。此外，該研究發(fā)現(xiàn)表皮ACRs相比于其他細(xì)胞類型的ACRs保守性較低，這可能表明這些物種的L1來源的表皮層經(jīng)歷了更快速的調(diào)控進(jìn)化。最后，研究人員鑒定并表征了一組與抑制性組蛋白修飾H3K27me3重疊的保守ACRs，這表明它們可能是由進(jìn)化保留下來的類沉默子CREs。
④ 總體而言，這種比較基因組學(xué)方法揭示了植物細(xì)胞類型特異性CRE進(jìn)化的動態(tài)特征。
圖5-利用scATAC-seq數(shù)據(jù)鑒定水稻的細(xì)胞類型和表征ACRs
5.玉米葉原基單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜揭示Kranz解剖結(jié)構(gòu)調(diào)控機(jī)制
英文標(biāo)題：Single-cell?resolved?differentiation?of?pre-Kranz?anatomy?in?maize?leaf?primordia發(fā)表期刊：bioRxiv
物種樣本：玉米（Zea mays?B73）、水稻（Oryza sativa Nipponbare）
測序策略：單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組、bulk-RNA seq
DOI：https://doi.org/10.1101/2024.07.10.602848
發(fā)布時間：2024.07.14
取樣策略：
從玉米葉原基：P3-P6原基分段取樣（M3tip、M3middle、M3base；M2top、M2base）、3-4 mm P4原基單細(xì)胞核分離；水稻葉片原基：5 mm原基分段取樣（R3tip、R3middle、R3base）
① 典型的C4植物如玉米，具有高度優(yōu)化的Kranz型葉片結(jié)構(gòu)，其中特定的花環(huán)狀結(jié)構(gòu)由圍繞葉脈緊密排列的葉肉細(xì)胞和維管束鞘細(xì)胞組成。
② 該研究區(qū)分了早期葉原基中維管發(fā)育的活躍區(qū)域，并通過分段的玉米和水稻葉原基的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，識別出可能參與早期Kranz發(fā)育的基因群。利用單細(xì)胞核RNA測序（snRNA-seq），進(jìn)一步探討了單個玉米葉原基中的細(xì)胞異質(zhì)性和發(fā)育軌跡。借助原位雜交技術(shù)，識別了mGM和原形成層的細(xì)胞簇，候選標(biāo)記基因顯示出不同但相互關(guān)聯(lián)的表達(dá)模式。維管標(biāo)記基因ZmSHR1的定位先于ZmEREB161和ZmEREB114，這兩者在原形成層的起始階段表達(dá)。
③ 該研究描繪了從發(fā)展中的玉米原基尖端向下的潛在維管束鞘細(xì)胞亞群和不同層次的葉肉細(xì)胞。
④ 綜上所述，該研究識別出潛在源自mGM或定位于原形成層的Kranz調(diào)控因子，并提供了在亞原基和單細(xì)胞分辨率下研究玉米和水稻葉脈發(fā)育的資源。
圖6-玉米P4葉原基的細(xì)胞異質(zhì)性
6.C4草本植物Kranz解剖結(jié)構(gòu)形成過程中預(yù)存調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重編程
英文標(biāo)題：Comparative spatiotemporal single cell transcriptomes reveal rewiring of pre-existing regulations during emergence of Kranz anatomy in C4?grasses發(fā)表期刊：bioRxiv
物種樣本：玉米（Zea mays）、高粱（Sorghum bicolor）、狗尾草（Setaria viridis）、水稻（Oryza sativa）
測序策略：單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組、高分辨率空間轉(zhuǎn)錄組
DOI：https://doi.org/10.1101/2024.10.28.620769
發(fā)布時間：2024.10.28
取樣策略：
單細(xì)胞核&空間轉(zhuǎn)錄組：12日齡玉米幼苗基部莖段葉原基（P3-P6），通過Cellpose 2.0識別細(xì)胞壁輪廓，提取14,037個空間單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組
① 世界上許多高產(chǎn)的糧食作物和生物能源作物都采用C4光合作用，這種光合作用通過基于Kranz解剖結(jié)構(gòu)的CO2濃縮機(jī)制實(shí)現(xiàn)了高光合效率。
② 該研究通過比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法，結(jié)合玉米（Zea mays）葉原基的單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以及三種C4植物（玉米、高粱、狗尾草）和一種C3植物（水稻）對應(yīng)葉組織的單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）圖譜，研究了Kranz解剖結(jié)構(gòu)發(fā)育和演化過程中涉及的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
③ 研究表明，Kranz解剖結(jié)構(gòu)的形成涉及對現(xiàn)有調(diào)控模塊的廣泛招募和改造，特別是SHR-SCR模塊和生長素信號通路。研究還發(fā)現(xiàn)，INDETERMINATE DOMAIN（IDD）家族轉(zhuǎn)錄因子（如IDD7和IDDP1）在這些模塊的改造中發(fā)揮了重要作用。這種對現(xiàn)有基因調(diào)控程序的廣泛招募和改造，是C4光合作用在演化過程中反復(fù)出現(xiàn)的基礎(chǔ)機(jī)制。
圖7-玉米葉原基的空間轉(zhuǎn)錄組研究
7.C3-C4中間型十字花科植物維管束鞘細(xì)胞在光呼吸穿梭中的功能
英文標(biāo)題：Single-nuclei sequencing of Moricandia arvensis reveals bundle sheath cell function in the photorespiratory shuttle of?C3-C4?intermediate Brassicaceae發(fā)表期刊：bioRxiv
物種樣本：C3-C4?中間型植物：堇娘芥（Moricandia arvensis）
測序策略：單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組
DOI：https://doi.org/10.1101/2024.12.02.626447
發(fā)布時間：2024.12.02
取樣策略：
單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組：取5-6葉期堇娘芥幼苗的第五、第六葉片（距地面5mm處）
公共數(shù)據(jù)：擬南芥葉片單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)
幼年期：0、1、2、3、4周；成年期：6、8、12周；老年期：6月、1年、2年。
① 基因表達(dá)的空間限制決定了細(xì)胞身份，并且是復(fù)雜植物性狀的基礎(chǔ)。在從C3光合作用向更高效的C4光合作用的進(jìn)化過程中，將甘氨酸脫羧酶反應(yīng)限制在維管束鞘細(xì)胞內(nèi)，通過光呼吸甘氨酸穿梭啟動了碳濃縮機(jī)制。通常認(rèn)為，這一進(jìn)化步驟在從祖先的C3光合作用向C4光合作用的過渡中起到了重要作用。執(zhí)行這一穿梭機(jī)制的植物通常被稱為C3-C4中間型植物或C2植物。在十字花科（Brassicaceae）家族中，這類植物至少獨(dú)立進(jìn)化了五次。然而，關(guān)于十字花科C3-C4中間型植物的生物化學(xué)研究僅限于少數(shù)關(guān)于葉肉細(xì)胞與維管束鞘細(xì)胞之間差異定位蛋白的案例研究。
② 該研究利用最近在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序方面的進(jìn)展，更好地理解新的細(xì)胞特化如何影響相互關(guān)聯(lián)的途徑。研究人員為具有C3-C4中間特征的堇娘芥（Moricandia arvensis）生成了單細(xì)胞核RNA測序數(shù)據(jù)集，并將其與公開可用的C3擬南芥（Arabidopsis thaliana）葉組織的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了比較，還通過免疫金標(biāo)記技術(shù)結(jié)合電子顯微鏡獨(dú)立驗(yàn)證了選定光呼吸蛋白的定位。
③ 該研究分析揭示了與光呼吸甘氨酸脫羧酶反應(yīng)直接相關(guān)的基因表達(dá)的變化，同時也包括相關(guān)途徑的基因表達(dá)轉(zhuǎn)移，例如銨的同化、特定氨基酸的合成、氧化還原調(diào)節(jié)和對M. arvensis維管束鞘的轉(zhuǎn)運(yùn)。相比之下，在C4植物中，這些基因的表達(dá)并未局限于這一細(xì)胞類型。
圖8-堇娘芥葉片單細(xì)胞圖譜
根據(jù)上述文獻(xiàn)，可以總結(jié)出應(yīng)用時空組學(xué)解析植物光合作用機(jī)制常用思路的技術(shù)路線圖。
自2023年6月，百創(chuàng)時空技術(shù)第一篇文章見刊至今19個月內(nèi)，使用百創(chuàng)時空技術(shù)文章累計(jì)33篇，在線文章平均影響因子12+，涉及哺乳動物（含人鼠）、水生（淡水及海洋）、禽類、兩棲、林木、作物及蔬菜等26個物種，25個組織類型，涵蓋腫瘤研究、疾病機(jī)制、再生、進(jìn)化、發(fā)育、綜述建議及技術(shù)算法等領(lǐng)域。
部分文章展示
1.腫瘤研究
中文題目：整合分子和空間分析揭示原位和侵襲性肢端黑色素瘤的進(jìn)化動態(tài)和腫瘤免疫相互作用
發(fā)表期刊：Cancer Cell
發(fā)表年份：2024
影響因子：48.8
DOI號：10.1016/j.jhazmat.2025.137375
文章采用技術(shù)：BMKMANU S1000、WES、Multi-region sequencing、Bulk RNA seq、10X Chromium、CODEX
樣本類型：人原位黑色素瘤（AMis）和侵襲性黑色素瘤（iAM）的腫瘤組織，相鄰正常皮膚，外周血
文章簡介：
為在空間水平探究 APOE+CD163+ 巨噬細(xì)胞亞群與 EMT 腫瘤細(xì)胞的互相作用，研究人員利用百創(chuàng)S1000空間轉(zhuǎn)錄技術(shù)對10例 AM 樣本進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)（數(shù)據(jù)中能夠明確區(qū)分表皮的基底層、棘層、顆粒層以及汗腺和血管，腫瘤區(qū)域高表達(dá)黑色素基因MLANA、PMEL、TYPR?和 DCT）。
數(shù)據(jù)表明（與單細(xì)胞數(shù)據(jù)聯(lián)合分析）C3 亞型的 EMT 腫瘤細(xì)胞占比高，并且有 APOE+CD163+ 巨噬細(xì)胞的浸潤，巨噬細(xì)胞與 EMT 腫瘤細(xì)胞具有共定位特征。CellChat 互作分析驗(yàn)證了 APOE+CD163+ 巨噬細(xì)胞的高度受體配體互作，與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組結(jié)果高度一致（APOE+/CD163+ 巨噬細(xì)胞是空間中 IGF 通路網(wǎng)絡(luò)的發(fā)送者（sender）和影響者（Influencer））。使用空間單細(xì)胞蛋白組學(xué)對患者腫瘤免疫微環(huán)境進(jìn)行了深入分析，結(jié)果顯示APOE+CD163+ TAM和EMThigh腫瘤細(xì)胞存在高度相關(guān)的定位，這與空間轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果一致。
2.疾病機(jī)制
中文題目：單細(xì)胞RNA測序研究全氟辛酸誘導(dǎo)的小鼠胚胎著床損傷
發(fā)表期刊：Journal of Hazardous Materials
發(fā)表年份：2025
影響因子：12.2
DOI號：https://doi.org/10.1073/pnas.2310163120
文章采用技術(shù)：BMKMANU DG1000、Bulk RNA seq、LC-MS/MS
樣本類型：鼠子宮
文章簡介：
全氟辛酸（PFOA）是一種環(huán)境持久性化學(xué)物質(zhì)，對人類健康構(gòu)成顯著風(fēng)險(xiǎn)。研究表明PFOA會影響女性生殖，但其對子宮內(nèi)膜容受性和潛在機(jī)制的具體影響尚不清楚。
該研究通過小鼠模型，研究了低劑量PFOA暴露對子宮內(nèi)膜容受性的影響。結(jié)果表明，PFOA暴露顯著損害了子宮內(nèi)膜容受性，導(dǎo)致胚胎著床率顯著下降。利用單細(xì)胞RNA測序技術(shù)，研究者全面分析了PFOA破壞子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞功能和發(fā)育的具體機(jī)制。值得注意的是，研究者發(fā)現(xiàn)ANGPTL（血管生成素樣）信號通路失調(diào)，這一通路對于子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞之間的通信至關(guān)重要，最終導(dǎo)致胚胎著床失敗。這些發(fā)現(xiàn)為PFOA的生殖毒性提供了新的見解，并強(qiáng)調(diào)了針對環(huán)境污染物相關(guān)不孕癥治療干預(yù)的潛在靶點(diǎn)。
3.再生研究
中文題目：空間轉(zhuǎn)錄組測序揭示番茄愈傷組織芽再生的分子機(jī)制
發(fā)表期刊：PNAS
發(fā)表年份：2023
影響因子：10.1
DOI號：https://doi.org/10.1073/pnas.2310163120
文章采用技術(shù)：BMKMANU S1000、Stereo-seq、10X Visium、10X Chromium
樣本類型：番茄愈傷組織
文章簡介：
該研究首次揭示了番茄愈傷組織內(nèi)部細(xì)胞的異質(zhì)性，并在單細(xì)胞水平上詳細(xì)解析了激素信號和重要調(diào)控因子在各種細(xì)胞和組織中的表達(dá)情況。研究結(jié)果不僅發(fā)現(xiàn)了表皮和芽原基細(xì)胞的亞型和功能，還揭示了綠色組織（chlorenchyma）細(xì)胞在芽原基細(xì)胞位置和分化發(fā)展中的重要作用，以及光照如何通過促進(jìn)綠色組織細(xì)胞的發(fā)育和激活雷帕霉素靶蛋白TOR來推動芽再生過程。
4.綜述建議
中文題目：系統(tǒng)比較基于測序的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法
發(fā)表期刊：Nature Methods
發(fā)表年份：2024
影響因子：36.1
DOI號：?10.1038/s41592-024-02325-3
文章采用技術(shù)：BMKMANU S1000、Stereo-seq、Visium、Slide-seq V2、Salus、DynaSpatial、DBiT-seq、PIXEL-seq、Slide-tag、Curio Seeker、HDST、In situ hybridization
樣本類型：小鼠胚胎（眼球）、成年小鼠大腦（海馬）、小鼠嗅球
文章簡介：
空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（sST）技術(shù)使得在組織水平上測量基因表達(dá)的空間分布成為可能。然而，目前對于不同sST平臺的系統(tǒng)性比較研究還較為缺乏，技術(shù)之間的差異和數(shù)據(jù)集的多樣性給標(biāo)準(zhǔn)化評估指標(biāo)的制定帶來了挑戰(zhàn)。
該研究建立了一套具有明確組織學(xué)結(jié)構(gòu)的參考組織和區(qū)域，并利用這些參考組織生成數(shù)據(jù)，比較了11種sST方法。研究發(fā)現(xiàn)，分子擴(kuò)散是不同方法和組織之間的變量參數(shù)，顯著影響有效分辨率。
此外，空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)展示了單細(xì)胞數(shù)據(jù)所不具備的獨(dú)特屬性，例如增強(qiáng)捕獲模式化稀有細(xì)胞狀態(tài)及其特定標(biāo)記物的能力，盡管這種能力受到測序深度和分辨率等多種因素的影響。該研究為生物學(xué)家選擇sST平臺提供了指導(dǎo)，有助于促進(jìn)評估標(biāo)準(zhǔn)的共識形成，并為未來基準(zhǔn)測試工作建立框架，可作為開發(fā)和評估空間轉(zhuǎn)錄組分析計(jì)算工具的黃金標(biāo)準(zhǔn)。
5.發(fā)育研究
中文題目：組織學(xué)和單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組分析揭示玉米莖葉枕發(fā)育中韌皮纖維細(xì)胞的特化功能和調(diào)控葉片角度的關(guān)鍵因子
發(fā)表期刊：Molecular Plant
發(fā)表年份：2024
影響因子：27.5
DOI號：10.1016/j.molp.2024.05.001
文章采用技術(shù)：BMKMANU DG1000、Bulk RNA seq、Chip-seq、RNA原位雜交、CRISPR/Cas9
樣本類型：玉米莖葉
文章簡介：
葉片角度（Leaf Angle, LA）是影響玉米種植密度和產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。然而，調(diào)控葉片角度形成的機(jī)制尚不清楚。該研究通過對不同玉米自交系的莖葉枕區(qū)域進(jìn)行比較組織學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)葉片角度大小顯著受到莖葉枕上表皮韌皮纖維細(xì)胞（SC）的初始伸長和隨后的木質(zhì)化的影響。通過批量和單細(xì)胞核RNA測序，生成了莖葉枕區(qū)域的全面轉(zhuǎn)錄組圖譜，并鑒定了許多可能影響其特化為SC的下皮細(xì)胞富集基因。
此外，研究者功能驗(yàn)證了兩個編碼非典型bHLH轉(zhuǎn)錄因子的基因bHLH30及其同源基因bHLH155，它們在伸長的上表皮細(xì)胞中高表達(dá)。遺傳分析表明，bHLH30和bHLH155正向調(diào)控葉片角度的擴(kuò)張，分子實(shí)驗(yàn)表明它們能夠激活細(xì)胞伸長和SC木質(zhì)化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。這些發(fā)現(xiàn)突出了莖葉枕上表皮SC在通過限制莖葉枕細(xì)胞的進(jìn)一步延伸和增強(qiáng)機(jī)械強(qiáng)度來調(diào)控葉片角度方面的特化功能。莖葉枕區(qū)域的單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組圖譜不僅加深了研究者對葉片角度調(diào)控的理解，還為現(xiàn)代玉米育種中優(yōu)化植物結(jié)構(gòu)提供了許多潛在靶點(diǎn)。
6.技術(shù)算法
中文題目：利用基于膜的邊界定義和提高單細(xì)胞分辨率來提高空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)
發(fā)表期刊：Small Methods
發(fā)表年份：2025
影響因子：15.36
DOI號：?10.1002/smtd.202401056
文章采用技術(shù)：BMKMANU S1000、Stereo-seq、scRNA-seq
樣本類型：小鼠（腦、腸和肝），球墨西哥鈍口螈（腦、腸和肝）
文章簡介：
準(zhǔn)確界定細(xì)胞邊界是空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（Spatial Transcriptomics, ST）的技術(shù)難題。目前常用的方法是基于細(xì)胞核染色或數(shù)學(xué)推導(dǎo)，這些方法要么排除了細(xì)胞質(zhì)，要么只能確定假設(shè)性的邊界。
該研究提出了一種新的細(xì)胞邊界定義方法：利用基因編碼的熒光蛋白對細(xì)胞膜進(jìn)行標(biāo)記，從而能夠在組織切片上精確定位細(xì)胞內(nèi)的測序位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄本。與基于細(xì)胞核的方法相比，這種基于細(xì)胞膜的方法顯著增加了捕獲的基因數(shù)量，小鼠和墨西哥鈍口螈肝臟中基因數(shù)量分別增加了67%和119%。
此外，該方法獲得的表達(dá)譜與單細(xì)胞 RNA 測序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)更為一致，顯示出更合理的聚類和明顯的細(xì)胞類型特異性標(biāo)記。該方法還提高了單細(xì)胞分辨率，能夠更好地識別稀有細(xì)胞類型并詳細(xì)解析墨西哥鈍口螈大腦和腸的空間域。除了常規(guī)細(xì)胞外，該方法還能夠準(zhǔn)確識別小鼠肝臟中的多核細(xì)胞和無核細(xì)胞，展示了其分析復(fù)雜組織和器官的能力，這是以往方法無法實(shí)現(xiàn)的。該研究為改善空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)提供了一種強(qiáng)大的工具，具有廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的潛力。
7.進(jìn)化研究
中文題目：追蹤空氣鳳梨從陸地到空中生態(tài)位的進(jìn)化和遺傳足跡
發(fā)表期刊：Nature Communications
發(fā)表年份：2024
影響因子：14.919
DOI號：10.1038/s41467-024-53756-7
文章采用技術(shù)：BMKMANU S1000、Stereo-seq、SMART-seq、16S rRNA測序、全基因組重測序、基因組組裝
樣本類型：空氣鳳梨亞科植物
文章簡介：
該研究以鳳梨科的空氣鳳梨亞科為模型植物，探索其起源、進(jìn)化和多樣性。通過基于核轉(zhuǎn)錄組序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分析，發(fā)現(xiàn)核心空氣鳳梨起源于約1130萬年前的安第斯山脈。安第斯山脈的地質(zhì)抬升推動了空氣鳳梨向儲水型和空氣型的分化?；蚪M和轉(zhuǎn)錄組分析揭示了與儲水型和吸收性毛狀體等適應(yīng)性特征相關(guān)的基因變異和丟失。此外，研究還發(fā)現(xiàn)了空氣鳳梨葉表皮中特定的固氮細(xì)菌群落，可能是其獲取氮素的潛在來源。該研究為理解空氣鳳梨對空中生態(tài)位的適應(yīng)性進(jìn)化提供了多組學(xué)視角。
在短短19個月間，百創(chuàng)時空技術(shù)已在科研領(lǐng)域綻放出耀眼光芒，見刊文章數(shù)量穩(wěn)步增長，影響因子成績斐然，研究范圍橫跨多物種與多組織類型，領(lǐng)域覆蓋更是廣泛而深入。這不僅是對百創(chuàng)時空技術(shù)先進(jìn)性與實(shí)用性的有力證明，也為眾多科研工作者開辟了新的研究路徑。未來，百創(chuàng)時空技術(shù)會持續(xù)創(chuàng)新突破，在更多未知領(lǐng)域開疆拓土，助力科研成果不斷涌現(xiàn)，為推動生命科學(xué)進(jìn)步與技術(shù)革新貢獻(xiàn)更為強(qiáng)大的力量！?
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文章標(biāo)題：Spatiotemporal dynamics of early oogenesis in pigs
期刊名稱：Genome Biology
影響因子：10.1
合作單位：青島農(nóng)業(yè)大學(xué)
發(fā)表日期：2025.01.02
研究方法：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組（10x Chromium）、空間轉(zhuǎn)錄組（10x Visium）、高分辨率空間轉(zhuǎn)錄組（BMKMANU S1000）、免疫熒光
百邁客生物為該研究中的E65胚胎卵巢提供了BMKMANU S1000空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)服務(wù)。
研究背景
在發(fā)育中的哺乳動物卵巢中，卵泡的位置對其生物學(xué)功能具有重要影響。休眠卵泡主要位于卵巢皮質(zhì)外部，對雌性生育周期長短具有重要影響，而生長卵泡則位于髓質(zhì)區(qū)域，對雌性生育的起始至關(guān)重要。然而，目前對胚胎階段卵巢微環(huán)境形成機(jī)制的理解尚不深入，這主要是由于該過程發(fā)生在胚胎期，涉及多種異質(zhì)細(xì)胞類型的協(xié)同作用。
在小鼠中，原始生殖細(xì)胞從外胚層遷移到生殖脊并在性腺中增殖，隨后在特定時間點(diǎn)沿前后軸異步啟動減數(shù)分裂。最近的研究顯示，這一過程與經(jīng)典的維甲酸信號無關(guān)，而是通過TEX14形成細(xì)胞間橋來實(shí)現(xiàn)。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了生殖細(xì)胞微環(huán)境在決定其發(fā)育命運(yùn)中的關(guān)鍵作用。
目前對卵巢發(fā)育中卵母細(xì)胞的研究主要集中在基因表達(dá)上，但對卵母細(xì)胞在卵泡發(fā)生過程中的細(xì)微空間定位及主要體細(xì)胞類型的空間動力學(xué)特征了解有限。通過空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和單細(xì)胞RNA測序技術(shù)，該研究揭示了豬早期卵巢發(fā)育中的皮質(zhì)-髓質(zhì)梯度，并發(fā)現(xiàn)人豬之間卵母細(xì)胞空間定位的保守性，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了卵巢微環(huán)境在決定卵母細(xì)胞命運(yùn)中的重要作用。
材料方法
研究材料：通過人工授精培育妊娠豬（三元雜交：Landrace、Large White和Duroc），分別在受精后45、55、65和75天采集胚胎階段的豬卵巢樣本。
研究方法：scRNA-seq（E45、E55、E65、E75胚胎卵巢，共計(jì)18,956個高質(zhì)量細(xì)胞，10x Genomics Chromium）；空間轉(zhuǎn)錄組（E45、E55、E65、E75胚胎卵巢，10x Visium；E65胚胎卵巢，BMKMANU S1000）
分析方法：空間轉(zhuǎn)錄組解卷積（Cell2location）；RNA速度分析（Velocyto和scVelo）；單細(xì)胞軌跡推斷（Cellrank）；同源基因轉(zhuǎn)化（biomaRt）；細(xì)胞通訊分析（CellphoneDB、biomaRt、ktplots）；蛋白互作分析；GO富集分析；基因模塊分析（Hotspot）
驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：免疫熒光；圖像分析和定量分析；Western blotting；卵巢組織體外培養(yǎng)
研究結(jié)果
1.豬早期卵子發(fā)生的單細(xì)胞圖譜的構(gòu)建
為了深入揭示豬卵巢早期卵子發(fā)生的時空發(fā)育特征，研究者將單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）與10× Visium空間轉(zhuǎn)錄組（ST）技術(shù)相結(jié)合，對豬卵巢發(fā)育過程中的細(xì)胞空間屬性進(jìn)行了系統(tǒng)分析。4個發(fā)育時間點(diǎn)（E45、E55、E65和E75；scRNA-seq各包括2個胚胎；ST：E45、E55、E65各包括2個胚胎，E75，1個胚胎），其中包括早期卵子發(fā)生的各階段。保留了18,956個高質(zhì)量細(xì)胞，共鑒定出17個聚類，包含9種主要細(xì)胞類型：生殖細(xì)胞、雙潛能前顆粒細(xì)胞、上皮前顆粒細(xì)胞、性腺間質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管周圍細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞。
圖1-發(fā)育中的豬卵巢的scRNA-seq
2.豬卵巢空間轉(zhuǎn)錄組的細(xì)胞類型解卷積
為了揭示卵巢發(fā)育過程中不同細(xì)胞類型的空間動態(tài)變化，研究者進(jìn)行了細(xì)胞類型的解卷積分析。盡管scRNA-seq技術(shù)為剖析復(fù)雜組織中的細(xì)胞異質(zhì)性提供了有力工具，但它缺乏細(xì)胞的空間位置信息。因此，研究者采用10× Visium空間轉(zhuǎn)錄組（ST）技術(shù)進(jìn)行測序，以更好地展現(xiàn)豬卵巢發(fā)育過程中不同細(xì)胞類型的空間動態(tài)變化。研究者首先對ST數(shù)據(jù)進(jìn)行了質(zhì)量評估，確保數(shù)據(jù)質(zhì)量符合分析要求。隨后，利用scRNA-seq數(shù)據(jù)作為參考，通過Cell2location算法對ST數(shù)據(jù)進(jìn)行了細(xì)胞類型的解卷積，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞類型的高分辨率定位。
通過解卷積分析，研究者發(fā)現(xiàn)在E45和E55階段，細(xì)胞類型的空間分布相對較為“隨機(jī)”。然而，隨著發(fā)育進(jìn)展到E65階段，研究者觀察到了一個明顯的空間分布模式：生殖細(xì)胞在E45-E55階段隨機(jī)分布在豬卵巢中，而在E65-E75階段則主要定位于皮層區(qū)域，僅有少量位于髓質(zhì)區(qū)域。對于前顆粒細(xì)胞群，我們觀察到了兩種具有不同空間定位模式的細(xì)胞類型：BPG細(xì)胞在E55之前隨機(jī)分布，并逐漸在E75時集中于髓質(zhì)區(qū)域；而EPG細(xì)胞則在整個發(fā)育過程中始終位于卵巢表面。
為進(jìn)一步驗(yàn)證分析結(jié)果，研究者進(jìn)行了全組織染色實(shí)驗(yàn)，使用生殖細(xì)胞標(biāo)志物DDX4和前顆粒細(xì)胞標(biāo)志物KRT19對E45至E75的胎兒卵巢進(jìn)行染色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與ST數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致。此外，研究者還分析了這些陽性細(xì)胞在卵巢背腹軸上的空間分布，并通過熒光強(qiáng)度分析確認(rèn)了生殖細(xì)胞和前顆粒細(xì)胞在皮層和髓質(zhì)區(qū)域的不同分布模式。這些發(fā)現(xiàn)為深入理解豬卵巢發(fā)育過程中細(xì)胞類型的空間動態(tài)變化提供了重要線索。
圖2-基于scRNA-seq數(shù)據(jù)使用Cell2location的ST的解卷積
3.空間尺度解析精細(xì)尺度豬生殖細(xì)胞發(fā)育軌跡
為了深入理解生殖細(xì)胞在空間環(huán)境中的發(fā)育過程，研究者提取了生殖細(xì)胞進(jìn)行重新聚類。通過對生殖細(xì)胞群的精細(xì)分析，研究者發(fā)現(xiàn)了五個對應(yīng)的細(xì)胞簇，分別是有絲分裂生殖細(xì)胞（FGC_mitotic）、表達(dá)MECOM和ATM的前減數(shù)生殖細(xì)胞（Oogonia_STRA8）、表達(dá)SYCP1和DMC1的減數(shù)分裂生殖細(xì)胞（Oogonia_meiotic）、表達(dá)FIGLA和NANOS1的早期卵母細(xì)胞（Pre_oocyte）以及表達(dá)ZP4和ZP3的卵母細(xì)胞（Oocyte）。
為了深入了解早期豬卵母細(xì)胞生成過程中模塊基因的功能富集情況，研究人員采用Hotspot算法，利用生殖細(xì)胞的scRNA-seq數(shù)據(jù)識別了相關(guān)基因模塊，共鑒定出11個功能各異的基因模塊。通過將單個模塊投影到UMAP圖中，確定了具有簇特異性的信息性基因模塊。剖析了早期豬卵母細(xì)胞生成過程中的基因表達(dá)譜后，研究人員進(jìn)一步在空間環(huán)境中研究了這一過程。通過對ST芯片上的生殖細(xì)胞進(jìn)行解卷積，揭示了早期卵母細(xì)胞生成的皮質(zhì)-髓質(zhì)梯度。為了驗(yàn)證上述分析，研究人員使用生殖細(xì)胞標(biāo)記DDX4和減數(shù)分裂生殖細(xì)胞細(xì)線期標(biāo)記γH2AX進(jìn)行了全組織染色實(shí)驗(yàn)，以定位在不同階段啟動減數(shù)程序的生殖細(xì)胞。評估了C-M軸的熒光強(qiáng)度后發(fā)現(xiàn)在E45和E55卵巢中，γH2AX信號沿C-M軸的水平相似，而在E65至E75卵巢中，γH2AX信號在內(nèi)皮層達(dá)到峰值，在髓質(zhì)區(qū)域則減少。
圖3-使用空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)（ST）對生殖細(xì)胞空間位置模式的特征化
為了進(jìn)一步驗(yàn)證分析，研究人員還在同一E65卵巢組織上使用了更高分辨率（BMKMANU S1000；Spot點(diǎn)大小約為10微米）的平臺進(jìn)行了ST測序。結(jié)果與E65時的Visium ST解卷積一致，使用S1000平臺在E65時可視化ZP3陽性卵母細(xì)胞的空間位置也證實(shí)了其在內(nèi)皮層的表達(dá)。
圖4-生殖細(xì)胞異質(zhì)性及空間位置模式的特征描述
綜上所述，研究人員成功地在單細(xì)胞分辨率下再現(xiàn)了豬生殖細(xì)胞的發(fā)育過程，并闡明了豬卵巢組織中生殖細(xì)胞的空間分布模式。
4.跨物種分析揭示了豬與人類之間生殖細(xì)胞基因表達(dá)程序及空間位置模式的保守性
為了深入理解哺乳動物卵母細(xì)胞生成的空間調(diào)控機(jī)制，研究人員進(jìn)行了跨物種分析。研究團(tuán)隊(duì)首先獲取了妊娠后19周人類卵巢的空間轉(zhuǎn)錄組（ST）數(shù)據(jù)，并將其與豬E65時期的ST數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較，以分析卵母細(xì)胞生成各階段生殖細(xì)胞的空間位置模式。與人類情況一致的是，生殖細(xì)胞標(biāo)記DDX4與5mC和5hmC的共染色顯示，在E55和E75豬卵巢中，5mC和5hmC信號在DDX4陽性細(xì)胞中不可檢測，且主要在周圍性腺體細(xì)胞中表達(dá)。這些結(jié)果進(jìn)一步揭示，除了保守的基因表達(dá)程序外，人類和豬在早期卵母細(xì)胞生成過程中的表觀遺傳重編程模式也是保守的。
為了研究豬和人類早期卵母細(xì)胞生成過程中皮質(zhì)-髓質(zhì)梯度是否保守，研究人員基于ST數(shù)據(jù)探索了卵母細(xì)胞生成各階段生殖細(xì)胞的空間位置模式。對于早期卵母細(xì)胞階段的生殖細(xì)胞，這些細(xì)胞在卵巢內(nèi)皮質(zhì)區(qū)域有清晰定位，而在人類中，這些細(xì)胞主要位于內(nèi)皮質(zhì)和外髓質(zhì)區(qū)域，且在內(nèi)皮質(zhì)區(qū)域豐度更高。到了卵母細(xì)胞階段，豬和人類中這些生殖細(xì)胞的位置模式相似，主要位于外髓質(zhì)區(qū)域。通過評估生殖細(xì)胞到卵巢表面的相對距離（以卵巢寬度標(biāo)準(zhǔn)化），觀察到豬和人類早期卵母細(xì)胞生成過程均顯示出生殖細(xì)胞的皮質(zhì)-髓質(zhì)梯度定位。這些數(shù)據(jù)不僅揭示了豬和人類早期卵母細(xì)胞生成過程中保守的基因表達(dá)程序和表觀遺傳重編程模式，還強(qiáng)調(diào)了兩種物種在整個早期卵母細(xì)胞生成階段空間動態(tài)的保守性。
圖5-豬與人卵巢ST數(shù)據(jù)的跨物種比較分析
5.基于空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（ST）技術(shù)解析豬卵巢發(fā)育過程中兩種顆粒細(xì)胞譜系的時空特性
在發(fā)育中的卵巢中，顆粒細(xì)胞與生殖細(xì)胞相互作用，形成了卵巢的基本功能單位，即卵泡。因此，研究人員接下來提取了顆粒細(xì)胞譜系，并使用UMAP進(jìn)行了細(xì)胞聚類分析，共鑒定出10個細(xì)胞簇。分析了潛在時間基因表達(dá)動態(tài)和顆粒細(xì)胞前體發(fā)育軌跡中wave II型顆粒細(xì)胞（PreGC_II）的命運(yùn)決定。與PreGC_I相比，簇6和7中的基因在PreGC_II命運(yùn)決定中起關(guān)鍵作用，如WNT6、GREM1和SFRP4，這些結(jié)果共同強(qiáng)調(diào)了WNT信號分子在豬顆粒細(xì)胞前體命運(yùn)決定中的保守作用。此外，ALDH1A2的上調(diào)表明，醛脫氫酶家族成員1A2可能在wave II顆粒細(xì)胞發(fā)育中發(fā)揮重要作用。
使用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（ST）技術(shù)對wave I型顆粒細(xì)胞前體（PreGC_I）和wave II型顆粒細(xì)胞前體（PreGC_II）的標(biāo)志性基因進(jìn)行了空間定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LHX9（PreGC_I的標(biāo)志）和GREM1（PreGC_II的標(biāo)志）的信號從E45到E75在卵巢中呈現(xiàn)特定的空間分布模式。在E65和E75，GREM1的信號明顯環(huán)繞著DDX4（生殖細(xì)胞的標(biāo)志）的信號，表明卵巢卵泡組裝的早期階段，wave II型顆粒細(xì)胞（來源于皮質(zhì)區(qū)域的顆粒細(xì)胞前體）在卵巢卵泡組裝過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。
接下來，研究人員分析了顆粒細(xì)胞譜系的空間特性，進(jìn)行了細(xì)胞類型反卷積，并觀察到卵巢表面上皮（OSE）細(xì)胞群主要位于豬卵巢的表面，并隨著發(fā)育的進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量增加。在E45時，I型顆粒細(xì)胞前體（PreGC_I）細(xì)胞廣泛分布在髓質(zhì)中，部分位于皮質(zhì)中；在E65時，觀察到I型顆粒細(xì)胞前體（PreGC_I）和II型顆粒細(xì)胞前體（PreGC_II）分別呈現(xiàn)出特定的皮質(zhì)和髓質(zhì)分布模式。通過免疫熒光分析進(jìn)一步驗(yàn)證了這些發(fā)現(xiàn)，上述結(jié)果共同揭示了豬卵巢發(fā)育過程中顆粒細(xì)胞譜系的空間時間特性。
圖6-使用ST技術(shù)表征前顆粒細(xì)胞的發(fā)育軌跡及其空間定位模式
6.豬卵巢發(fā)育期間主要體細(xì)胞類型的空間特性
除了生殖細(xì)胞和顆粒細(xì)胞外，研究人員還進(jìn)一步以更高分辨率分析了GI（間質(zhì)細(xì)胞）和Sm（平滑肌細(xì)胞）這兩種體細(xì)胞在豬卵巢中的空間分布模式，因?yàn)檫@兩種細(xì)胞類型在豬卵巢中顯示出特征性分布，表明它們可能在塑造卵巢微環(huán)境方面發(fā)揮作用，這對早期卵子發(fā)生至關(guān)重要。
將GI和Sm的標(biāo)記基因整合到空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)中，觀察到這些體細(xì)胞的空間位置隨著從E45到E75的發(fā)育進(jìn)展而發(fā)生變化。通過RNA速度分析確定的分化譜系細(xì)胞和增殖狀態(tài)細(xì)胞在E45和E55時的卵巢中隨機(jī)分布，而在E65時，觀察到這些細(xì)胞在卵巢皮質(zhì)中呈現(xiàn)出明顯的空間聚集模式，特別是在生殖細(xì)胞附近。這些發(fā)現(xiàn)共同揭示了豬卵巢發(fā)育早期體細(xì)胞空間位置模式的動態(tài)變化，表明它們在形成對早期卵子發(fā)生至關(guān)重要的卵巢微環(huán)境中發(fā)揮潛在作用。
圖7-利用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（ST）表征類固醇生成細(xì)胞譜系的異質(zhì)性和空間位置模式
7.空間共定位分析揭示了皮質(zhì)區(qū)和髓質(zhì)區(qū)存在截然不同的微環(huán)境，強(qiáng)調(diào)了其在調(diào)控生殖細(xì)胞命運(yùn)中的關(guān)鍵作用
在闡明了發(fā)育中的豬卵巢中主要細(xì)胞類型的時空特征后，研究人員接下來研究了空間微環(huán)境的變化如何影響發(fā)育中卵巢的細(xì)胞命運(yùn)決定。首先對細(xì)胞類型豐度進(jìn)行了非負(fù)矩陣分解（NMF），以研究發(fā)育中卵巢中細(xì)胞的空間共定位。NMF分解的應(yīng)用成功地表征了位于皮質(zhì)和髓質(zhì)的生殖細(xì)胞niche，并揭示了與不同空間來源的生殖細(xì)胞共定位的體細(xì)胞。為了全面理解細(xì)胞-細(xì)胞通信模式的功能性，研究人員使用CellphoneDB進(jìn)行GO富集分析，識別了不同區(qū)域生殖細(xì)胞與體細(xì)胞之間的配體-受體（L-R）對，發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)和髓質(zhì)區(qū)域之間細(xì)胞-細(xì)胞通信模式的功能富集結(jié)果不同。
此外，研究人員觀察到皮質(zhì)區(qū)域的L-R對顯著富集了NOTCH信號通路，PreGC_ii0和PreGC_ii8表達(dá)NOTCH信號介導(dǎo)因子NOTCH2，而其配體DLK1和JAG1則在向減數(shù)分裂進(jìn)程中的生殖細(xì)胞中表達(dá)，結(jié)果表明NOTCH2在豬早期生殖細(xì)胞命運(yùn)決定中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在髓質(zhì)區(qū)域細(xì)胞-細(xì)胞通信分析揭示了在卵細(xì)胞階段的生殖細(xì)胞表達(dá)了參與原始卵泡組裝的配體，包括BMP4和BDNF，而它們相應(yīng)的受體，包括BMPR1A、BMPR1B和SORT1，則由PreGC i4和PreGC i7表達(dá)。研究人員發(fā)現(xiàn)髓質(zhì)區(qū)域的體細(xì)胞表達(dá)了一系列細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白，而皮質(zhì)區(qū)域則不是這樣，表明ECM蛋白在調(diào)節(jié)豬卵母細(xì)胞生成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞通訊分析，研究人員接下來探討了在使用從E55卵巢皮質(zhì)和髓質(zhì)中分離的卵巢組織進(jìn)行體外條件下，補(bǔ)充NOTCH信號抑制劑DAPT和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑多西環(huán)素是否會影響生殖細(xì)胞命運(yùn)。從E55胎兒卵巢中解剖出皮質(zhì)和髓質(zhì)組織，將這些組織進(jìn)行體外培養(yǎng)，并在用DAPT處理10天后觀察到皮質(zhì)卵巢組織中減數(shù)分裂標(biāo)志物STRA8的表達(dá)水平顯著降低，而髓質(zhì)卵巢組織則沒有這種情況。相反，在用基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑多西環(huán)素處理10天后，觀察到卵泡形成標(biāo)志物L(fēng)HX8的表達(dá)水平降低，而在皮質(zhì)組織中未觀察到可比的影響。綜上所述，這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持了在空間背景下的細(xì)胞-細(xì)胞通訊分析，并強(qiáng)調(diào)了卵巢微環(huán)境在調(diào)節(jié)生殖細(xì)胞命運(yùn)中的重要作用。
圖8-卵巢皮質(zhì)和髓質(zhì)之間細(xì)胞-細(xì)胞通訊模式的比較
研究總結(jié)
綜上所述，該研究基于單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組測序，深入探討了豬早期卵子發(fā)生過程中的時空基因表達(dá)譜和卵巢微環(huán)境的空間組織，以及這些特征在人類中的保守性。這些發(fā)現(xiàn)不僅豐富了我們對豬繁殖性狀形成復(fù)雜機(jī)制的認(rèn)識，還為生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究提供了新的視角和方法。
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